Sel punca hematopoietik dari darah tali pusat

Darah tali pusat merupakan sumber sel punca hematopoietik yang baik dalam hal potensi proliferasi dan kemampuan repopulasi sel hematopoietik. Telah berulang kali ditunjukkan bahwa pada saat lahir, darah tali pusat mengandung sejumlah besar sel progenitor hematopoietik yang berkomitmen lemah. Beberapa penulis percaya bahwa keuntungan dari transplantasi sel punca hematopoietik darah tali pusat adalah kurangnya kebutuhan untuk mencari donor yang kompatibel dengan antigen HLA. Menurut pendapat mereka, ketidakmatangan sistem kekebalan bayi baru lahir menyebabkan berkurangnya aktivitas fungsional sel imunokompeten dan, karenanya, insiden penyakit graft-versus-host yang parah lebih rendah daripada dengan transplantasi sumsum tulang. Pada saat yang sama, tingkat kelangsungan hidup transplantasi sel darah tali pusat tidak lebih rendah daripada sel sumsum tulang, bahkan dalam kasus penggunaan sejumlah kecil HSC yang diberikan per 1 kg berat badan pasien. Namun, menurut pendapat kami, masalah jumlah optimal sel darah tali pusat yang ditransplantasikan yang diperlukan untuk pencangkokan yang efektif dalam tubuh penerima, kompatibilitas imunologisnya, dan sejumlah aspek lain dari masalah transplantasi sel punca hematopoietik darah tali pusat memerlukan analisis yang lebih serius.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Memperoleh sel induk hematopoietik dari darah tali pusat

Prosedur untuk memperoleh sel punca hematopoietik dari darah tali pusat memerlukan pengambilannya segera setelah kelahiran anak dan pemisahannya dari plasenta saat plasenta masih dalam kandungan atau di luar kandungan, serta selama operasi caesar, tetapi juga di luar kandungan. Telah dibuktikan bahwa jika waktu dari saat kelahiran hingga pemisahan bayi baru lahir dari plasenta dikurangi menjadi 30 detik, volume darah tali pusat yang diperoleh meningkat rata-rata 25-40 ml. Jika prosedur ini dilakukan kemudian, jumlah darah yang sama akan hilang. Telah ditetapkan bahwa pemisahan dini anak dari plasenta tidak menimbulkan konsekuensi negatif apa pun bagi bayi baru lahir.

Lembaga Penelitian Hematologi dan Transfusiologi Rusia telah mengembangkan teknologi yang efektif dan murah untuk memperoleh darah tali pusat baik melalui kelahiran normal ((70,2+25,8) ml) maupun operasi caesar ((73,4+25,1) ml). Telah diusulkan suatu metode pemisahan darah tali pusat dengan hasil sel berinti dan sel mononuklear yang cukup tinggi - masing-masing (83,1+9,6) dan (83,4+14,1)%. Telah ditingkatkan suatu metode kriopreservasi darah tali pusat, yang menjamin pengawetan sel mononuklear dan CFU-GM yang tinggi - masing-masing (96,8+5,7) dan (89,6+22,6). Telah ditetapkan efisiensi metode drainase pengumpulan darah tali pusat menggunakan wadah Kompoplast-300 (Rusia). Penulis mengumpulkan darah tali pusat segera setelah kelahiran anak dan pemisahannya dari plasenta, dalam kondisi penempatan plasenta di dalam rahim atau di luar rahim. Sebelum tusukan vena umbilikalis, tali pusat diobati satu kali dengan 5% tingtur yodium, dan kemudian dua kali dengan 70% etil alkohol. Darah mengalir secara spontan melalui tabung penghubung ke dalam wadah. Prosedur pengumpulan memakan waktu tidak lebih dari 10 menit. Volume rata-rata dari 66 sampel darah tali pusat yang dikumpulkan dengan drainase adalah (72+28) ml, dan jumlah leukosit dalam volume total sampel rata-rata adalah (1,1+0,6) x 107. Ketika menganalisis darah tali pusat untuk sterilitas (kontaminasi bakteri, HIV-1, virus hepatitis B dan C, sifilis dan infeksi sitomegalovirus), antibodi IgG terhadap virus hepatitis C terdeteksi hanya dalam satu sampel. Dalam penelitian lain, plasenta ditempatkan permukaan janin di bawah pada bingkai khusus segera setelah lahir, tali pusat diobati dengan larutan yodium 5% dan 75% etil alkohol. Vena umbilikalis dikeringkan menggunakan jarum dari sistem transfusi (G16). Darah mengalir ke dalam wadah secara spontan. Volume rata-rata darah yang dikumpulkan dengan cara ini adalah (55+25) ml. Dalam karya G. Kogler et al. (1996), darah tali pusat dikumpulkan menggunakan metode tertutup dan diperoleh volume darah yang besar - rata-rata (79+26) ml. Penulis mencatat bahwa di antara 574 sampel darah tali pusat, sekitar 7% mengandung kurang dari 40 ml darah, yang tidak memungkinkannya digunakan untuk transplantasi. K. Isoyama et al. (1996), yang mengumpulkan darah tali pusat dengan eksfusi aktif menggunakan spuit, memperoleh rata-rata 69,1 ml darah (volume darah tali pusat bervariasi dari 15 hingga 135 ml). Akhirnya, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) berhasil memperoleh rata-rata 94 ml darah tali pusat (dari 56 sampai 143 ml) melalui kateterisasi vena umbilikalis.

Untuk mengurangi risiko infeksi iatrogenik dan kontaminasi dengan sekresi ibu, sistem pengumpulan darah tertutup telah dikembangkan berdasarkan sistem transfusi yang banyak digunakan dari Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (AS), yang mengandung 62,5 ml CPDA (sitrat-fosfat-dekstrosa dengan adenin) sebagai antikoagulan. Teknologi untuk memperoleh bahan tersebut sangat penting untuk menyiapkan sampel berkualitas tinggi dalam hal volume, kandungan, dan kemurnian suspensi sel. Dari metode yang ada untuk mengumpulkan darah tali pusat, yang secara konvensional diklasifikasikan menjadi sistem tertutup, semi terbuka, dan terbuka, preferensi harus diberikan kepada yang pertama, karena sistem tertutup secara signifikan mengurangi risiko kontaminasi mikroba pada bahan tersebut, serta kontaminasi suspensi sel dengan sel ibu.

A. Nagler et al. (1998) melakukan analisis komparatif terhadap efisiensi ketiga sistem pengumpulan darah tali pusat. Pada varian pertama, prosedur dilakukan dalam sistem tertutup dengan cara mengeluarkan darah langsung ke dalam wadah. Pada varian kedua, darah tali pusat diperoleh dengan pengeluaran darah secara aktif dengan spuit MP1 diikuti dengan pembilasan vena plasenta dan pembuangan darah secara bersamaan ke dalam wadah (metode terbuka). Pada varian ketiga, darah dikumpulkan dalam sistem semi terbuka dengan cara mengeluarkannya secara aktif dengan spuit dan membilasnya melalui arteri umbilikalis dengan pengeluaran secara bersamaan ke dalam wadah. Pada varian pertama, penulis memperoleh darah tali pusat dalam volume (76,4+32,1) ml dengan kandungan leukosit (10,5+3,6) x 106 ^dalam 1 ml darah. Pada varian kedua, indikator yang sesuai adalah (174,4+42,8) ml dan (8,8+3,4) x 106 ^/ ml; pada yang ketiga - (173,7+41,3) ml dan (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Infeksi paling sering pada sampel darah tali pusat diamati saat menggunakan sistem terbuka. Korelasi langsung ditetapkan antara massa plasenta dan volume darah yang diambil - dengan peningkatan massa plasenta, jumlah darah yang diambil meningkat.

Setelah pengambilan darah tali pusat, tahap pemisahan dilanjutkan - isolasi sel mononuklear dan pemurnian suspensi sel dari eritrosit. Dalam kondisi eksperimental, sel berinti diisolasi dengan sedimentasi menggunakan metilselulosa selama lisis eritrosit dengan amonium klorida. Akan tetapi, metilselulosa tidak boleh digunakan untuk tujuan klinis, karena kehilangan sel induk hematopoietik mencapai 50-90%. Lisis eritrosit juga hampir tidak pernah dilakukan di klinik karena volume larutan kerja yang besar, meskipun persentase isolasi sel berinti dengan fenotipe CD34+, serta sel progenitor dengan fungsi CFU-GM dan CFU-GEMM dengan cara ini secara signifikan lebih tinggi. Munculnya cara baru untuk mengisolasi sel mononuklear dalam gradien densitas, larutan densitas buyant (BDS72), dilaporkan. Zat ini memiliki parameter fisiologis berikut: pH - 7,4, osmolalitas - 280 mOsm/kg, densitas - 1,0720 g/ml. Menurut penulis, metode ini dapat digunakan untuk mengisolasi hingga 100% sel CD34-positif dan membuang 98% eritrosit. Namun, BDS72 belum digunakan di klinik.

Dalam metode yang disetujui untuk mengisolasi sel berinti dari darah tali pusat, larutan pati hidroksi etil 10% atau larutan gelatin 3% biasanya digunakan. Efisiensi sedimentasi eritrosit dan isolasi sel berinti dalam kedua kasus tersebut kira-kira sama. Namun, ketika gelatin digunakan sebagai agen sedimentasi, dimungkinkan untuk memperoleh jumlah CFU-GM yang sedikit lebih besar daripada saat menggunakan pati hidroksi etil. Diasumsikan bahwa perbedaan dalam efisiensi isolasi CFU-GM disebabkan oleh laju sedimentasi yang berbeda dari fraksi individu sel berinti atau kemampuan molekul pati hidroksi etil untuk diserap pada permukaan reseptor sel hematopoietik dan dengan demikian memblokir sensitivitasnya terhadap faktor perangsang koloni yang digunakan dalam kultur CFU-GM secara in vitro. Meskipun demikian, kedua sedimentator tersebut mungkin cocok untuk mengisolasi sel berinti saat membuat bank darah tali pusat skala besar.

Metode pemisahan dan kriopreservasi darah tali pusat pada dasarnya tidak berbeda dengan metode yang digunakan dalam penanganan sel punca hematopoietik dari darah tepi dan sumsum tulang donor dewasa. Namun, saat menyiapkan sejumlah besar sampel darah tali pusat untuk bank darah, metode pemisahan pertama-tama harus berbiaya rendah. Oleh karena itu, sayangnya, saat ini, untuk kebutuhan klinis, metode rutin yang telah teruji untuk mengisolasi dan mengkriopreservasi sel darah tali pusat digunakan, dan metode yang lebih efektif, tetapi mahal tetap menjadi pilihan para peneliti.

Secara umum, kriteria untuk menilai jumlah sel hematopoietik dan persyaratan untuk memeriksa sampel darah tali pusat guna mengidentifikasi agen infeksius telah disetujui. Untuk memastikan keamanan transplantasi sel hematopoietik darah tali pusat, semua sampel darah harus diperiksa terutama untuk infeksi yang ditularkan secara hematogen dan penyakit genetik. Sejumlah penulis merekomendasikan metode khusus tambahan untuk memeriksa darah tali pusat guna mendiagnosis penyakit genetik seperti talasemia-a, anemia sel sabit, defisiensi adenosin deaminase, agammaglobulinemia Bruton, penyakit Hurler dan Ponter.

Berdasarkan rekomendasi L. Ticheli dan rekan penulis (1998), setiap sampel darah tali pusat harus diuji untuk sel berinti, sel CD34-positif, dan CFU-GM, pengetikan HLA harus dilakukan, dan golongan darah harus ditentukan menurut ABO dan faktor Rh-nya. Selain itu, kultur bakteriologis, pengujian serologis untuk infeksi HIV dan sitomegalovirus, HBsAg, hepatitis C virus, HTLY-I dan HTLV-II (leukemia sel T manusia), sifilis, dan toksoplasmosis harus dilakukan. Reaksi berantai polimerase untuk infeksi sitomegalovirus dan HIV adalah wajib.

Prosedur pengambilan darah tali pusat harus dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip bioetika medis. Sebelum pengambilan darah, perlu untuk mendapatkan persetujuan dari ibu hamil untuk melakukannya. Percakapan awal dengan ibu hamil untuk mendapatkan persetujuan yang jelas untuk semua manipulasi, mulai dari pengeluaran darah hingga pengisian dokumentasi, hanya dilakukan oleh petugas medis. Dalam hal apa pun tidak diperbolehkan untuk melakukan prosedur ini oleh personel dengan pendidikan biologi, kimia, farmasi atau non-medis lainnya, karena melanggar norma-norma bioetika dan hak asasi manusia yang telah ditetapkan. Dalam kasus tes positif untuk pembawa HBsAg, adanya antibodi terhadap patogen hepatitis C, infeksi HIV dan sifilis, darah tali pusat tidak diambil, dan sampel darah yang sudah diambil ditolak dan dimusnahkan. Perlu dicatat bahwa pembawa infeksi laten pada bayi baru lahir jauh lebih jarang daripada pada orang dewasa, oleh karena itu, kemungkinan penularan hematogen dan perkembangan komplikasi infeksi selama infus sel hematopoietik darah tali pusat secara signifikan lebih rendah daripada dalam kasus penggunaan sumsum tulang donor dewasa untuk transplantasi.

Aspek penting dari penggunaan klinis darah tali pusat adalah evaluasi transplantasi, yang didasarkan pada penentuan jumlah sel induk hematopoietik dalam sampel darah tali pusat dan dosis sel yang diperlukan untuk transplantasi. Saat ini, standar untuk jumlah optimal sel darah tali pusat yang diperlukan untuk transplantasi belum dikembangkan. Tidak ada sudut pandang yang diterima secara umum bahkan pada parameter rutin seperti jumlah sel CD34-positif dan CFU-GM. Beberapa penulis mengevaluasi potensi sel hematopoietik dengan menganalisis kultur jangka panjang dengan penentuan kandungan unit pembentuk koloni yang umum pada granulosit, eritrosit, monosit, dan megakariosit - CFU-GEMM.

Namun, dalam situasi klinis, evaluasi standar transplantasi darah tali pusat biasanya hanya melibatkan penentuan jumlah sel berinti atau sel mononuklear.

Penyimpanan sel induk hematopoietik darah tali pusat

Ada juga beberapa masalah dalam teknologi penyimpanan sel hematopoietik darah tali pusat. Ketika melakukan kriopreservasi sel induk hematopoietik, untuk mencapai mode pembekuan yang optimal, perlu untuk mengurangi volume darah tali pusat sebanyak mungkin, dan juga untuk mengeluarkan eritrosit terlebih dahulu untuk menghindari hemolisis dan risiko mengembangkan reaksi ketidakcocokan untuk antigen eritrosit (ABO, Rh). Berbagai metode untuk mengisolasi sel berinti cocok untuk tujuan ini. Pada awal tahun 90-an abad terakhir, metode yang paling banyak digunakan adalah mengisolasi sel berinti dalam gradien kepadatan berdasarkan Ficoll dengan kepadatan 1,077 g / ml atau Percoll dengan kepadatan 1,080 g / ml. Pemisahan darah tali pusat dalam gradien kepadatan memungkinkan isolasi sel mononuklear yang dominan, tetapi menyebabkan hilangnya sel progenitor hematopoietik yang signifikan - hingga 30-50%.

Efisiensi sedimentasi pati hidroksi etil dalam proses isolasi sel hematopoietik darah tali pusat dinilai secara berbeda. Beberapa penulis menunjukkan kualitas pemisahan yang rendah menggunakan metode ini, sementara peneliti lain, sebaliknya, di antara semua metode yang mungkin, memberikan preferensi untuk mengisolasi HSC darah tali pusat menggunakan larutan pati hidroksi etil 6%. Pada saat yang sama, efisiensi sedimentasi sel hematopoietik yang tinggi ditekankan, yang menurut beberapa data, mencapai 84% hingga 90%.

Para pendukung sudut pandang yang berbeda percaya bahwa hampir semua metode fraksinasi dikaitkan dengan hilangnya sel berinti dalam jumlah besar dan mengusulkan untuk melakukan pemisahan dengan sentrifugasi, membagi darah tali pusat menjadi 3 fraksi: eritrosit, cincin leukosit, dan plasma. Dengan mengisolasi sel dengan cara ini, penulis menemukan bahwa kandungan sel mononuklear, sel progenitor hematopoietik awal, dan sel dengan imunofenotipe CD34+ pada akhirnya masing-masing berjumlah 90, 88, dan 100% dari tingkat awal. Nilai serupa untuk peningkatan sel darah tali pusat yang dimurnikan dengan metode ini juga diperoleh oleh peneliti lain: setelah sedimentasi, 92% sel berinti, 98% sel mononuklear, 96% sel CD34-positif, dan 106% unit pembentuk koloni diisolasi.

Pada akhir tahun 1990-an, gelatin banyak digunakan sebagai agen sedimentasi. Dalam praktik klinis, gelatin telah digunakan untuk mengisolasi sel induk hematopoietik dari darah tali pusat sejak tahun 1994. Saat menggunakan larutan gelatin 3%, efisiensi isolasi sel berinti mencapai 88-94%. Penggunaan gelatin dalam skala besar untuk membuat bank darah tali pusat telah menegaskan keunggulannya dibandingkan agen sedimentasi lainnya. Analisis komparatif efisiensi semua metode di atas untuk mengisolasi sel berinti dalam kondisi penggunaan berurutan pada masing-masing sampel darah tali pusat yang diuji telah membuktikan bahwa larutan gelatin 3% merupakan agen sedimentasi yang optimal dalam hal hasil sel mononuklear dengan fenotipe CD34+/CD45+, serta dalam hal jumlah CFU-GM dan CFU-GEMM. Metode yang menggunakan gradien densitas Ficoll, serta penggunaan pati hidroksi etil dan metilselulosa, secara signifikan kurang efektif, dengan hilangnya sel hematopoietik mencapai 60%.

Perluasan volume transplantasi sel punca darah tali pusat tidak hanya terkait dengan pengembangan metode untuk perolehannya, tetapi juga penyimpanannya. Ada banyak masalah yang terkait langsung dengan penyiapan darah tali pusat untuk penyimpanan jangka panjang dan pemilihan teknologi optimal untuk kriopreservasi sampelnya. Di antaranya adalah masalah kelayakan melakukan prosedur pemisahan, menggunakan berbagai media kriopreservasi, dan menerapkan metode untuk menyiapkan sel yang telah dicairkan untuk transplantasi. Pengangkutan sampel darah tali pusat asli sering dilakukan dari daerah yang jauh dari pusat hematologi. Dalam hal ini, muncul masalah periode penyimpanan yang dapat diterima untuk darah tali pusat sejak saat perolehannya hingga awal kriopreservasi, yang menjadi sangat penting saat membuat bank darah tali pusat.

Sebuah studi tentang aktivitas fungsional sel hematopoietik dalam darah tali pusat setelah penyimpanan jangka panjang (hingga 12 tahun) dalam nitrogen cair telah menunjukkan bahwa sekitar 95% sel hematopoietik tidak kehilangan kapasitas proliferatifnya yang tinggi selama periode ini. Dalam karya S. Yurasov dan rekan penulis (1997), terbukti bahwa menyimpan darah tali pusat pada suhu kamar (22°C) atau pada suhu 4°C selama 24 dan 48 jam tidak secara signifikan mengurangi viabilitas sel hematopoietik, yang masing-masing sebesar 92 dan 88% dari tingkat awal. Namun, jika periode penyimpanan diperpanjang hingga tiga hari, jumlah sel berinti yang hidup dalam darah tali pusat berkurang secara signifikan. Pada saat yang sama, penelitian lain telah menunjukkan bahwa ketika disimpan selama 2-3 hari pada suhu 22 atau 4°C, viabilitas granulosit dewasa, bukan sel hematopoietik, yang pertama dan terutama menderita.

Viabilitas sel punca hematopoietik darah tali pusat dapat dipengaruhi secara negatif oleh komponen sistem pengumpulan darah tali pusat. Analisis efek berbagai antikoagulan yang mekanisme kerjanya disebabkan oleh pengikatan ion kalsium (ACD, EDTA, XAPD-1) pada sel progenitor hematopoietik dalam kondisi penyimpanan darah tali pusat selama 24 hingga 72 jam mengungkapkan efek negatifnya pada viabilitas sel berinti. Dalam hal ini, penulis merekomendasikan penggunaan PBS (larutan penyangga fosfat) dengan penambahan heparin asli tanpa bahan pengawet pada konsentrasi 20 U/ml, yang menurut pendapat mereka, memungkinkan peningkatan periode penyimpanan darah tali pusat yang tidak terfraksinasi menjadi 72 jam dan mempertahankan aktivitas fungsional unit pembentuk koloni. Namun, studi tentang keamanan CFU-GM dan CFU-G menunjukkan bahwa waktu penyimpanan darah tali pusat sebelum kriopreservasi tidak boleh melebihi sembilan jam. Jelasnya, prinsip yang harus diterapkan dalam kasus ini adalah jika terdapat data yang saling bertentangan, maka periode penyimpanan minimum yang direkomendasikan untuk darah tali pusat harus digunakan dan pembekuan terprogram terhadap sel-sel yang diisolasi harus dimulai sesegera mungkin.

Saat membekukan sel induk hematopoietik darah tali pusat, larutan DMSO 10% biasanya digunakan sebagai krioprotektan. Namun, selain efek krioprotektif yang nyata, dimetil sulfoksida dalam konsentrasi tersebut juga memiliki efek sitotoksik langsung, bahkan dengan paparan minimal pada sel hematopoietik darah tali pusat. Untuk mengurangi efek sitotoksik DMSO, suhu paparan nol digunakan, kecepatan semua manipulasi ditingkatkan, dan beberapa kali pencucian dilakukan setelah pencairan sampel darah tali pusat.

Sejak 1995, Institut Hematologi dan Transfusiologi dari Akademi Ilmu Kedokteran Ukraina telah mengembangkan arahan ilmiah yang ditujukan untuk studi komprehensif tentang darah tali pusat sebagai sumber alternatif sel induk hematopoietik. Secara khusus, teknologi baru untuk kriopreservasi suhu rendah sel hematopoietik dari darah tali pusat yang tidak terfraksinasi dan terfraksinasi telah dikembangkan. Polivinilpirolidon medis molekul rendah digunakan sebagai krioprotektan. Metode kriopreservasi darah tali pusat yang tidak terfraksinasi didasarkan pada teknologi asli untuk pra-persiapan sel untuk pembekuan dan metode untuk pemrosesan khusus suspensi sel segera sebelum transplantasi.

Salah satu faktor terpenting yang memengaruhi tingkat aktivitas fungsional sel induk hematopoietik yang dikriopreservasi adalah laju pendinginan suspensi sel, terutama selama fase kristalisasi. Pendekatan perangkat lunak untuk memecahkan masalah kecepatan dan waktu pembekuan memberikan peluang besar untuk menciptakan metode kriopreservasi yang sederhana dan sangat efektif, tanpa mencuci suspensi sel dari krioprotektan sebelum transplantasi.

Tahapan yang paling berbahaya bagi kelangsungan hidup sel selama persiapannya adalah tahap pembekuan dan pencairan langsung. Saat membekukan sel hematopoietik, sebagian besar dari mereka dapat hancur pada saat transisi media antarsel dari fase cair ke fase padat - kristalisasi. Untuk mengurangi persentase kematian sel, krioprotektan digunakan, mekanisme kerja dan efisiensi krioprotektannya cukup tercakup dalam literatur ilmiah.

Arah yang menjanjikan untuk mengoptimalkan metode kriopreservasi untuk sel sumsum tulang dan darah tali pusat adalah kombinasi konsentrasi rendah beberapa krioprotektan dengan mekanisme kerja berbeda dalam satu larutan, misalnya, DMSO yang bekerja pada tingkat intraseluler dan pati hidroksi etil atau albumin, yang memiliki efek perlindungan ekstraseluler.

Untuk kriopreservasi sel darah tali pusat, larutan DMSO 20% secara tradisional digunakan, yang dituangkan perlahan ke dalam suspensi sel dengan pengadukan mekanis konstan dalam penangas es hingga rasio yang sama (1:1) antara volume krioprotektan dan suspensi sel tercapai. Konsentrasi akhir dimetil sulfoksida adalah 10%. Suspensi sel kemudian didinginkan dalam unit kriogenik terprogram pada laju GS/menit hingga -40°C, setelah itu laju pendinginan ditingkatkan menjadi 10°C/menit. Setelah mencapai -100°C, wadah berisi suspensi sel ditempatkan dalam nitrogen cair (-196°C). Dengan teknik kriopreservasi ini, pengawetan sel mononuklear yang aktif secara fungsional setelah pencairan mencapai 85% dari tingkat semula.

Modifikasi metode kriopreservasi ditujukan untuk mengurangi konsentrasi DMSO dengan menambahkan pati hidroksi etil (konsentrasi akhir dimetil sulfoksida dan pati hidroksi etil masing-masing adalah 5 dan 6%). Efisiensi tinggi dari kombinasi krioprotektan tersebut diamati saat membekukan suspensi sel myeloid, dan dengan sitoproteksi yang tidak kalah dibandingkan saat hanya menggunakan larutan dimetil sulfoksida 10%. Jumlah sel berinti yang hidup mencapai 96,7% dari tingkat awal, dan aktivitas fungsionalnya, yang diperkirakan berdasarkan jumlah CFU-GM, adalah 81,8%.

Ketika menggunakan larutan dimetil sulfoksida dalam konsentrasi dari 5 hingga 10% dalam kombinasi dengan 4% pati hidroksi etil (konsentrasi akhir), ditemukan bahwa keamanan sel CD34-positif dalam rentang dimetil sulfoksida tersebut tetap hampir tidak berubah. Pada saat yang sama, ketika konsentrasi dimetil sulfoksida menurun dari 5 menjadi 2,5%, kematian besar-besaran sel darah tali pusat diamati - jumlah unit sel yang hidup menurun dari 85,4 menjadi 12,2%. Penulis lain juga sampai pada kesimpulan bahwa larutan dimetil sulfoksida 5 dan 10% (dalam versi penulis - dalam kombinasi dengan serum autolog) yang memberikan sitoproteksi dengan efisiensi maksimum selama kriopreservasi HSC darah tali pusat. Selain itu, pengawetan tinggi sel yang dibekukan dan dicairkan secara berurutan dicatat dalam kasus kombinasi dimetil sulfoksida 5 atau 10% dengan larutan pati hidroksi etil 4%, terutama pada laju pendinginan terkontrol GS/menit. Dalam penelitian lain, larutan krioprotektif digunakan yang terdiri dari tiga bahan - DMSO, albumin manusia murni, dan medium RPMI dalam rasio 1:4:5, yang ditambahkan ke suspensi sel dengan rasio volume yang sama (konsentrasi akhir dimetil sulfoksida adalah 5%). Setelah pencairan dalam penangas air pada suhu +4 GS, pengawetan CFU-GM melebihi 94%.

Beberapa penulis menyarankan penggunaan darah tali pusat yang tidak terfraksinasi untuk kriopreservasi, karena sejumlah besar sel hematopoietik hilang selama proses pembuangan sel darah merah. Dalam varian ini, larutan dimetil sulfoksida 10% digunakan untuk melindungi sel mononuklear dari efek merusak kriokristalisasi. Pembekuan dilakukan pada laju pendinginan konstan GS/menit hingga -80°C, setelah itu suspensi sel darah tali pusat diturunkan menjadi nitrogen cair. Metode pembekuan ini menghasilkan lisis sebagian sel darah merah, sehingga sampel darah tidak memerlukan fraksinasi. Setelah pencairan, suspensi sel dicuci dari hemoglobin bebas dan dimetil sulfoksida dalam larutan albumin manusia atau dalam serum darah autolog pasien dan digunakan untuk transplantasi.

Pengawetan sel progenitor hematopoietik setelah pencairan darah tali pusat yang tidak terfraksinasi memang lebih tinggi daripada darah tali pusat yang terfraksinasi, namun, karena kriostabilitas beberapa eritrosit, masalah pascatransfusi yang serius dapat timbul karena transfusi eritrosit yang tidak kompatibel dengan ABO. Selain itu, volume darah yang tidak terfraksinasi yang disimpan meningkat secara signifikan. Dari sudut pandang klinis, kriopreservasi sel hematopoietik darah tali pusat yang sebelumnya diisolasi dan dimurnikan dari fraksi sel lain masih lebih disukai.

Secara khusus, metode kriopreservasi sel darah tali pusat yang difraksinasi telah dikembangkan, yang memungkinkan pembuangan eritrosit pada tahap persiapan pembekuan, di mana larutan pati hidroksi etil 6% digunakan sebagai bagian dari larutan pengganti plasma "Stabizol". Setelah pencairan, suspensi sel yang diperoleh dengan cara ini siap untuk penggunaan klinis tanpa manipulasi tambahan.

Dengan demikian, saat ini terdapat banyak metode kriopreservasi darah tali pusat yang cukup efektif. Perbedaan mendasarnya adalah bahwa sampel darah dibekukan tanpa difraksinasi atau mengalami pemisahan menjadi fraksi sel pada tahap persiapan dan sel berinti tanpa campuran eritrosit disiapkan.

Transplantasi sel induk hematopoietik darah tali pusat

Pada akhir tahun 1980-an dan awal tahun 1990-an, ditetapkan bahwa darah tali pusat, yang menyediakan dukungan hidup bagi janin selama kehamilan, memiliki kandungan sel punca hematopoietik yang tinggi. Kesederhanaan relatif dalam memperoleh sel darah tali pusat dan tidak adanya masalah etika yang jelas berkontribusi pada penggunaan sel punca darah tali pusat dalam praktik kedokteran. Transplantasi darah tali pusat pertama yang berhasil kepada seorang anak dengan anemia Fanconi menjadi titik awal untuk memperluas volume transplantasi sel punca darah tali pusat dan menciptakan sistem untuk penyimpanannya. Dalam sistem bank darah tali pusat dunia, yang terbesar adalah New York Placental Blood Center, yang berada dalam neraca National Institute of Health AS. Jumlah sampel darah tali pusat yang disimpan di bank ini mendekati 20.000. Jumlah penerima (kebanyakan anak-anak) yang telah menjalani transplantasi yang berhasil juga bertambah. Menurut Departemen Kesehatan AS, masa bebas kambuh pascatransplantasi penerima transplantasi darah tali pusat sudah melebihi 10 tahun.

Hal ini tidak mengherankan, karena banyak penelitian tentang potensi hematopoietik darah tali pusat telah menunjukkan bahwa dalam hal kuantitas dan kualitas sel punca paling awal, darah tali pusat tidak hanya tidak kalah dengan sumsum tulang orang dewasa, tetapi juga melampauinya dalam beberapa hal. Potensi proliferasi sel punca darah tali pusat yang lebih tinggi disebabkan oleh fitur ontogenetik pensinyalan seluler, keberadaan reseptor untuk faktor pertumbuhan spesifik pada HSC, kemampuan sel darah tali pusat untuk memproduksi faktor pertumbuhan secara autokrin, dan ukuran serta panjang telomer yang besar.

Dengan demikian, karakteristik genomik dan fenotipik sel punca hematopoietik darah tali pusat menentukan pencangkokan transplantasi berkualitas tinggi dengan potensi tinggi untuk pemulihan hematopoiesis donor dalam tubuh penerima.

Manfaat sel induk hematopoietik darah tali pusat

Di antara keuntungan nyata penggunaan sel punca hematopoietik darah tali pusat untuk transplantasi dibandingkan sumber sel hematopoietik lainnya, perlu dicatat bahwa risiko terhadap kesehatan donor hampir nol (jika kita tidak mempertimbangkan plasenta sebagai risiko tersebut) dan tidak diperlukannya anestesi umum. Penggunaan darah tali pusat memperluas kemungkinan transplantasi sel karena transplantasi yang sebagian kompatibel dengan HLA (ketidakcocokan dari satu hingga tiga antigen). Sebuah metode untuk penyimpanan jangka panjang sel hematopoietik darah tali pusat dalam keadaan beku telah dikembangkan, yang meningkatkan kemungkinan memperoleh jenis HLA yang langka dan mengurangi waktu untuk mencari transplantasi yang kompatibel dengan HLA untuk transplantasi alogenik. Pada saat yang sama, risiko mengembangkan infeksi laten tertentu yang ditularkan melalui cara yang dapat ditularkan berkurang secara signifikan. Selain itu, bentuk asuransi jiwa biologis yang murah muncul karena kemungkinan penggunaan sel darah tali pusat untuk transplantasi autologus.

Namun, karena volume darah yang bisa diambil dari plasenta sangat kecil (rata-rata tidak lebih dari 100 ml), maka timbul masalah dalam memperoleh jumlah darah sebanyak-banyaknya dari vena tali pusat, dengan tetap memperhatikan secara ketat kondisi risiko minimal kontaminasi bakteri pada sampel darah tali pusat yang diperoleh.

Sel hematopoietik primitif dari darah tali pusat biasanya diidentifikasi dengan keberadaan glikofosfoprotein CD34 pada permukaannya, serta berdasarkan sifat fungsionalnya dengan mempelajari klonogenisitas atau pembentukan koloni secara in vitro. Analisis komparatif menunjukkan bahwa dalam darah tali pusat dan sumsum tulang, kandungan maksimum sel CD34-positif dalam fraksi mononuklear masing-masing adalah 1,6 dan 5,0%, tingkat maksimum unit pembentuk koloni dalam subpopulasi sel CD34+ adalah 80 dan 25%, efisiensi kloning total sel CD34+ adalah 88 dan 58%, kandungan maksimum sel pembentuk koloni dengan potensi proliferasi tinggi (HPP-CFC dalam populasi CD34+) adalah 50 dan 6,5%. Perlu ditambahkan bahwa efisiensi kloning sel CD34+CD38 dan kemampuan untuk merespons stimulasi sitokin juga lebih tinggi dalam sel punca hematopoietik darah tali pusat.

Kombinasi antigen fenotipik Thy-1, CD34, dan CD45RA mengonfirmasi potensi proliferatif tinggi dari sel hematopoietik darah tali pusat, dan ekspresi ketiga antigen ini pada permukaan sel darah tali pusat menunjukkan bahwa sel tersebut tergolong sel punca. Selain itu, ditemukan bahwa darah tali pusat mengandung sel dengan fenotip CD34+ yang tidak memiliki penanda diferensiasi linier. Tingkat subpopulasi seluler dengan profil fenotip CD34+/Lin dalam darah tali pusat sekitar 1% dari jumlah total sel positif CD34. Sel progenitor hematopoietik darah tali pusat menghasilkan garis sel limfoid dan seri myeloid pluripoten dari diferensiasi sel linier, yang juga menunjukkan bahwa sel tersebut tergolong sel punca.

Seperti yang telah disebutkan, perbedaan yang signifikan antara sumsum tulang dan darah tali pusat adalah dalam jumlah sel hematopoietik yang digunakan untuk transplantasi yang diperoleh selama satu prosedur pengumpulan. Jika selama transplantasi sumsum tulang, hilangnya massa sel selama pemisahan, kriopreservasi, pencairan dan pengujian dapat diterima dalam 40-50%, maka untuk darah tali pusat, kehilangan sel tersebut sangat signifikan, karena jika jumlah HSC yang digunakan tidak mencukupi, transplantasi mungkin terbukti tidak efektif. Menurut G. Kogler et al. (1998), untuk transplantasi sel dengan berat badan penerima 10 kg, semua sampel darah tali pusat dapat menjadi transplantasi potensial (jumlah total sampel darah tali pusat yang dikumpulkan adalah 2098), dengan berat badan 35 kg - 67%, dan hanya 25% sampel yang dapat memberikan transplantasi yang efektif pada pasien dengan berat badan 50-70 kg. Situasi klinis ini menunjukkan perlunya mengoptimalkan dan meningkatkan efisiensi metode pengumpulan, reproduksi, dan penyimpanan sel darah tali pusat yang ada. Oleh karena itu, saat ini banyak dibahas dalam literatur mengenai masalah standarisasi metode pengumpulan, pengujian, pemisahan dan kriopreservasi darah tali pusat untuk pembuatan bank darah, pemanfaatannya di klinik, dan juga pengaturan mengenai syarat dan ketentuan penyimpanan sel punca hematopoietik darah tali pusat.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Pemanfaatan sel punca hematopoietik darah tali pusat dalam pengobatan

^{Biasanya, hingga 106 sel punca hematopoietik dapat diisolasi} dari darah tali pusat, jarang lebih. Terkait hal ini, pertanyaan apakah jumlah sel hematopoietik dari darah tali pusat tersebut cukup untuk memulihkan hematopoiesis pada penerima dewasa masih terbuka hingga saat ini. Pendapat tentang masalah ini terbagi. Beberapa peneliti yakin bahwa jumlah tersebut cukup untuk transplantasi ke anak-anak, tetapi terlalu sedikit untuk transplantasi ke orang dewasa, yang jumlah optimalnya adalah pengenalan (7-10) x 106 ^sel CD34-positif per 1 kg berat badan - rata-rata 7 x 108 ^per transplantasi. Dari perhitungan ini dapat disimpulkan bahwa satu sampel darah tali pusat mengandung 700 kali lebih sedikit sel punca hematopoietik daripada yang dibutuhkan untuk satu transplantasi ke pasien dewasa. Akan tetapi, penilaian kuantitatif tersebut dibuat dengan analogi dengan jumlah sel sumsum tulang yang ditransfusikan dan sama sekali tidak memperhitungkan fitur ontogenetik hematopoiesis.

Secara khusus, fakta potensi proliferatif yang lebih tinggi dari sel punca hematopoietik darah tali pusat dibandingkan dengan sel progenitor hematopoietik sumsum tulang diabaikan. Hasil studi potensi pembentukan koloni in vitro menunjukkan bahwa satu dosis darah tali pusat mampu memberikan pemulihan hematopoiesis penerima dewasa. Di sisi lain, tidak boleh dilupakan bahwa jumlah sel punca darah tali pusat menurun bahkan selama perkembangan embrio: kandungan sel CD34-positif dalam darah tali pusat menurun secara linier sebanyak 5 kali lipat dalam periode dari 20 minggu (darah untuk penelitian diperoleh selama penghentian kehamilan prematur) hingga 40 minggu kehamilan (periode persalinan fisiologis), yang disertai dengan ekspresi penanda sitodiferensiasi linier yang paralel dan terus meningkat.

Karena kurangnya pendekatan standar untuk penentuan kuantitatif sel progenitor dalam sampel darah tali pusat, perdebatan tentang dosis optimal sel induk hematopoietik darah tali pusat terus berlanjut. Beberapa peneliti percaya bahwa jumlah sel berinti dan sel mononuklear yang dihitung ulang untuk berat badan penerima, yaitu dosisnya, dapat digunakan sebagai kriteria untuk memilih sampel darah tali pusat. Beberapa penulis percaya bahwa ambang kuantitatif minimum sel CD34+ bahkan untuk autotransplantasi HSC adalah 2 x 106 ^/ kg. Pada saat yang sama, peningkatan dosis sel hematopoietik menjadi 5 x 106 ^sel /kg (hanya 2,5 kali) sudah memastikan perjalanan yang lebih baik dari periode pascatransplantasi awal, mengurangi kejadian komplikasi infeksi dan memperpendek durasi terapi antibiotik preventif.

Menurut E. Gluckman et al. (1998), dalam onkohematologi syarat keberhasilan transplantasi sel darah tali pusat adalah masuknya paling sedikit 3,7 x 107 ^sel berinti per 1 kg berat badan resipien. Bila dosis sel punca hematopoietik dikurangi menjadi 1 x 107 ^atau kurang sel berinti per 1 kg berat badan pasien, risiko kegagalan transplantasi dan kekambuhan kanker darah meningkat tajam. Perlu diketahui bahwa jumlah minimum sel progenitor yang diperlukan untuk pemulihan hematopoiesis yang cepat setelah alotransplantasi HSC masih belum diketahui. Secara teoritis, hal ini dapat dicapai dengan menggunakan satu sel, tetapi dalam praktik klinis transplantasi sumsum tulang, pencangkokan yang cepat dan stabil dijamin dengan transfusi paling sedikit (1-3) x 108 ^sel berinti per 1 kg berat badan pasien.

Sebuah studi terperinci baru-baru ini untuk menentukan jumlah optimal HSC dalam onkohematologi mencakup observasi pasien dalam tiga kelompok, yang dialokasikan tergantung pada kandungan sel CD34-positif dalam bahan yang ditransplantasikan. Pasien kelompok pertama diberikan (3-5) x 106 ^sel /kg. Dosis HSC pada pasien kelompok kedua adalah (5-10) x 106 ^sel /kg, dan pasien kelompok ketiga ditransplantasikan dengan lebih dari 10 x 106 ^sel CD34+/kg. Hasil terbaik diamati pada kelompok penerima yang menerima transplantasi dengan jumlah sel CD34-positif sama dengan (3-5) x 106 ^/ kg. Dengan peningkatan dosis sel yang ditransplantasikan di atas 5 x 106 ^/ kg, keuntungan yang signifikan secara statistik tidak terungkap. Dalam kasus ini, kandungan HSC yang sangat tinggi dalam transplantasi (> 10 x 10 ⁶ /kg) dikaitkan dengan reinfusi sejumlah besar sel tumor residual, yang menyebabkan kekambuhan penyakit. Hubungan langsung antara jumlah sel progenitor alogenik yang ditransplantasi dan perkembangan reaksi graft-versus-host belum ditetapkan.

Pengalaman dunia yang terakumulasi dalam transplantasi darah tali pusat menegaskan potensi repopulasi yang tinggi. Tingkat pencangkokan transplantasi darah tali pusat berkorelasi dengan jumlah sel berinti yang dimasukkan. Hasil terbaik diamati dengan transplantasi 3 x 10 ⁷ /kg, sedangkan untuk sumsum tulang dosis ini adalah 2 x 10 ⁸ /kg. Menurut data pusat koordinasi, pada akhir tahun 2000, 1200 transplantasi sel darah tali pusat dilakukan di seluruh dunia, terutama dari donor terkait (83%). Jelas bahwa darah tali pusat harus dipertimbangkan sebagai alternatif sumsum tulang untuk transplantasi pada pasien dengan hemoblastosis.

Pada saat yang sama, sifat neonatal dari sumber jaringan hematopoietik tali pusat menimbulkan optimisme karena adanya fitur fungsional HSC-nya. Pada saat yang sama, hanya pengalaman klinis yang dapat menjawab pertanyaan tentang kecukupan satu sampel darah tali pusat untuk memulihkan hematopoiesis pada penerima dewasa dengan aplasia hematopoietik. Transplantasi sel darah tali pusat digunakan dalam program perawatan untuk banyak penyakit tumor dan non-tumor: leukemia dan sindrom mielodisplastik, limfoma non-Hodgkin dan neuroblastoma, anemia aplastik, anemia Fanconi dan Diamond-Blackfan kongenital, defisiensi adhesi leukosit, sindrom Barr, penyakit Gunther, sindrom Hurler, talasemia.

Aspek imunologi transplantasi sel hematopoietik darah tali pusat perlu mendapat perhatian khusus dan kajian tersendiri. Telah dibuktikan bahwa dalam kasus transplantasi sel punca darah tali pusat dari donor dengan kompatibilitas HLA yang tidak lengkap, hasil transplantasi cukup memuaskan, yang menurut penulis, menunjukkan imunoreaktivitas sel darah tali pusat yang lebih rendah daripada sumsum tulang.

Studi terperinci tentang komposisi seluler darah tali pusat mengungkapkan ciri-ciri spektrum fenotipik sel efektor sistem imun dan aktivitas fungsionalnya, yang memungkinkan darah tali pusat dianggap sebagai sumber HSC dengan risiko yang relatif rendah untuk mengembangkan reaksi 'graft versus host'. Di antara tanda-tanda ketidakmatangan fungsional sel imunokompeten darah tali pusat, perlu dicatat ketidakseimbangan dalam produksi sitokin dan penurunan kepekaan terhadap regulasi sitokin dari respons imun. Penghambatan aktivitas limfosit sitotoksik yang dihasilkan dianggap sebagai faktor yang berkontribusi terhadap pembentukan toleransi imunologis terhadap jaringan hematopoietik yang ditransplantasikan. Dalam populasi limfosit darah tali pusat, berbeda dengan darah tepi dan sumsum tulang donor dewasa, limfosit yang tidak aktif dan belum matang serta sel penekan mendominasi. Hal ini menunjukkan berkurangnya kesiapan limfosit T darah tali pusat untuk respons imun. Ciri penting populasi monosit sel darah tali pusat adalah rendahnya kandungan sel penyaji antigen yang aktif dan lengkap secara fungsional.

Di satu sisi, rendahnya kematangan sel efektor sistem imun dalam darah tali pusat memperluas indikasi penggunaannya di klinik, karena fitur-fitur ini memberikan penurunan intensitas konflik imun antara sel donor dan resipien. Namun, di sisi lain, diketahui adanya korelasi antara tingkat perkembangan reaksi "graft versus host" dan efek antitumor transplantasi, yaitu perkembangan efek "graft versus leukemia". Dalam hal ini, sebuah penelitian dilakukan terhadap sitotoksisitas antitumor sel darah tali pusat. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa, meskipun respons sel darah tali pusat imunokompeten terhadap stimulasi antigen benar-benar melemah, limfosit yang terutama diaktifkan adalah sel pembunuh alami dan sel mirip pembunuh yang berperan aktif dalam mekanisme penerapan sitotoksisitas antitumor. Selain itu, subpopulasi limfosit dengan fenotipe CD16+CD56+ dan CD16"TCRa/p+ ditemukan dalam darah tali pusat. Diasumsikan bahwa sel-sel ini dalam bentuk aktifnya menerapkan reaksi "cangkok versus leukemia".

Di Institut Onkologi Akademi Ilmu Kedokteran Ukraina, sel hematopoietik kriopreservasi dari darah tali pusat diberikan kepada pasien kanker dengan hipoplasia hematopoietik persisten akibat kemoterapi dan radioterapi. Pada pasien tersebut, transplantasi sel punca hematopoietik dari darah tali pusat cukup efektif memulihkan hematopoiesis yang tertekan, sebagaimana dibuktikan oleh peningkatan terus-menerus dalam kandungan elemen terbentuk matang dalam darah tepi, serta peningkatan indikator yang mencirikan keadaan imunitas seluler dan humoral. Stabilitas efek repopulasi setelah transplantasi sel hematopoietik dari darah tali pusat memungkinkan radiasi dan kemoterapi berkelanjutan tanpa mengganggu jalannya pengobatan. Ada informasi tentang efisiensi yang lebih tinggi dari alotransplantasi sel punca darah tali pusat pada pasien onkohematologi: risiko tahunan kambuhnya penyakit tumor dengan penggunaannya adalah 25% versus 40% pada pasien dengan sumsum tulang alogenik yang ditransplantasikan.

Mekanisme kerja sel punca darah tali pusat yang dikriopreservasi harus dianggap sebagai hasil stimulasi humoral hematopoiesis resipien yang disebabkan oleh kemampuan unik sel neonatal untuk memproduksi faktor pertumbuhan hematopoietik secara autokrin, serta konsekuensi pencangkokan sementara sel donor (sebagaimana dibuktikan oleh peningkatan yang dapat diandalkan dalam kandungan hemoglobin janin dalam darah tepi resipien pada hari ke 7-15 setelah transfusi dibandingkan dengan data awal). Tidak adanya reaksi pascatransfusi pada resipien darah tali pusat merupakan hasil dari toleransi relatif sel imunokompetennya, serta kriteria kepercayaan untuk kecukupan biologis bahan yang dikriopreservasi.

Sel progenitor pembunuh limfosit T darah tali pusat mampu diaktifkan di bawah pengaruh stimulasi sitokin eksogen, yang digunakan untuk mengembangkan metode eks vivo dan in vivo baru untuk menginduksi sitotoksisitas antitumor elemen limfoid transplantasi untuk imunoterapi berikutnya. Selain itu, "ketidakmatangan" genom sel imunokompeten darah tali pusat memungkinkan mereka digunakan untuk meningkatkan aktivitas antitumor menggunakan metode pemodelan molekuler.

Saat ini, darah tali pusat telah banyak digunakan terutama dalam hematologi pediatrik. Pada anak-anak dengan leukemia akut, alotransplantasi sel induk hematopoietik darah tali pusat, dibandingkan dengan alotransplantasi sumsum tulang, secara signifikan mengurangi kejadian penyakit graft-versus-host. Namun, hal ini disertai dengan periode neutro- dan trombositopenia yang lebih lama dan, sayangnya, tingkat kematian pascatransplantasi 100 hari yang lebih tinggi. Periode pemulihan kadar granulosit dan trombosit yang lebih lama dalam darah tepi mungkin disebabkan oleh diferensiasi yang tidak memadai dari subpopulasi individu sel darah tali pusat positif CD34, sebagaimana dibuktikan oleh rendahnya tingkat penyerapan rhodamine radioaktif dan rendahnya ekspresi antigen CD38 pada permukaannya.

Pada saat yang sama, transplantasi sel punca hematopoietik dari darah tali pusat ke pasien dewasa, yang dilakukan karena tidak adanya donor sumsum tulang belakang yang tidak terkait dan kemungkinan memobilisasi HSC autolog, menunjukkan kelangsungan hidup bebas kekambuhan satu tahun yang tinggi pada kelompok pasien di bawah usia 30 tahun (73%). Perluasan rentang usia penerima (18-46 tahun) menyebabkan penurunan kelangsungan hidup hingga 53%.

Analisis kuantitatif sel dengan fenotip CD34+ dalam sumsum tulang dan darah tali pusat menunjukkan kandungannya yang lebih tinggi (3,5 kali) dalam sumsum tulang, tetapi dominasi sel yang signifikan dengan profil fenotip CD34+HLA-DR terlihat dalam darah tali pusat. Diketahui bahwa sel darah dengan penanda imunologi CD34+HLA-DR berproliferasi lebih aktif daripada sel dengan imunofenotip CD34+HLA-DR+, yang dikonfirmasi dalam studi eksperimental pertumbuhan kultur sel hematopoietik jangka panjang secara in vitro. Prekursor sel primitif dengan fenotip CD34+CD38 terkandung baik dalam darah tali pusat maupun sumsum tulang, tetapi sel darah tali pusat dengan set penanda CD34+CD38 memiliki aktivitas klonogenik yang lebih tinggi daripada sel hematopoietik dengan fenotip yang sama yang diisolasi dari sumsum tulang donor dewasa. Selain itu, sel darah tali pusat dengan imunofenotipe CD34+CD38 berkembang biak lebih cepat sebagai respons terhadap stimulasi sitokin (IL-3, IL-6, G-CSF) dan menghasilkan 7 kali lebih banyak koloni dalam kultur jangka panjang daripada sel sumsum tulang.

Bank Sel Punca Darah Tali Pusat

Untuk pengembangan yang tepat dari bidang baru pengobatan praktis - transplantasi sel punca darah tali pusat, serta untuk pelaksanaan transplantasi sel punca hematopoietik sumsum tulang, diperlukan jaringan bank darah yang luas, yang telah dibuat di AS dan Eropa. Jaringan bank darah tali pusat domestik disatukan oleh Netcord Bank Association. Kemanfaatan untuk menciptakan asosiasi bank darah tali pusat internasional ditentukan oleh fakta bahwa sejumlah besar sampel darah tali pusat yang diketik diperlukan untuk melakukan transplantasi yang tidak terkait, yang memungkinkan pemilihan donor yang identik dengan HLA. Hanya pembentukan sistem bank dengan penyimpanan sampel darah dari berbagai jenis HLA yang benar-benar dapat menyelesaikan masalah dalam menemukan donor yang diperlukan. Organisasi sistem bank darah tali pusat seperti itu memerlukan pengembangan awal norma etika dan hukum, yang saat ini sedang dibahas di tingkat internasional.

Untuk mendirikan bank darah tali pusat di Ukraina, serangkaian peraturan dan dokumen harus disusun.

Pertama-tama, ini adalah masalah standarisasi metode pengumpulan, fraksinasi, dan pembekuan darah tali pusat. Perlu untuk mengatur aturan pengumpulan darah tali pusat di rumah sakit bersalin sesuai dengan persyaratan etika medis, untuk menentukan volume minimum darah tali pusat yang memastikan keberhasilan transplantasi. Perlu untuk membandingkan dan menstandardisasi berbagai kriteria untuk menilai kualitas dan kuantitas sel progenitor hematopoietik, serta metode pengetikan HLA dan metode diagnostik untuk penyakit genetik dan infeksi yang dapat ditularkan selama infus sel darah tali pusat, untuk menetapkan kriteria umum untuk pemilihan donor yang sehat. Perlu juga dibahas masalah menciptakan fasilitas penyimpanan terpisah untuk serum, sel, dan DNA yang diperoleh dari darah tali pusat.

Sangatlah penting untuk mengatur jaringan komputer data darah tali pusat untuk dihubungkan dengan registri donor sumsum tulang belakang. Untuk pengembangan lebih lanjut transplantasi sel, perlu dikembangkan protokol khusus untuk membandingkan hasil transplantasi darah tali pusat dan sumsum tulang belakang dari kerabat yang identik dengan HLA dan donor yang tidak terkait. Standarisasi dokumentasi, termasuk persetujuan dari orang tua, serta pemberitahuan kepada ibu atau kerabat tentang penyakit genetik dan/atau infeksi yang terdeteksi pada anak, dapat membantu memecahkan masalah etika dan hukum penggunaan klinis sel darah tali pusat.

Kondisi yang menentukan untuk pengembangan transplantasi sel di Ukraina adalah penerapan Program Donasi Sel Punca Nasional dan pengembangan kerja sama internasional dengan negara lain melalui Asosiasi Donor Sumsum Dunia (WMDA), Program Donor Sumsum Nasional AS (NMDP), dan lembaga pendaftar lainnya.

Merangkum sejarah singkat perkembangan transplantasi sel punca hematopoietik darah tali pusat, kami mencatat bahwa asumsi pertama tentang kemungkinan penggunaan darah tali pusat di klinik, yang diungkapkan pada awal tahun 70-an, dikonfirmasi pada tahun 80-an oleh hasil penelitian eksperimental pada hewan, dan pada tahun 1988 transplantasi sel hematopoietik darah tali pusat pertama di dunia ke manusia dilakukan, setelah itu jaringan bank darah tali pusat global mulai dibuat. Dalam 10 tahun, jumlah pasien dengan sel hematopoietik darah tali pusat yang ditransplantasikan mendekati 800. Di antara mereka adalah pasien dengan berbagai penyakit tumor (leukemia, limfoma, tumor padat) dan non-tumor (imunodefisiensi kongenital, anemia, penyakit yang berhubungan dengan gangguan metabolik).

Kandungan prekursor sel awal dan yang telah terbentuk dalam darah tali pusat lebih tinggi daripada dalam darah tepi orang dewasa. Dalam hal jumlah unit pembentuk koloni granulosit-makrofag dan potensi proliferasinya, darah tali pusat secara signifikan melebihi darah tepi orang dewasa bahkan setelah pengenalan faktor pertumbuhan. Dalam kultur sel jangka panjang secara in vitro, aktivitas proliferasi dan viabilitas sel darah tali pusat yang lebih besar daripada sel sumsum tulang telah dicatat. Momen kritis dalam transplantasi sel induk darah tali pusat adalah jumlah dan potensi hematopoietik sel berinti, adanya infeksi sitomegalovirus, kompatibilitas HLA donor dan resipien, berat badan dan usia pasien.

Namun, transplantasi sel punca darah tali pusat harus dipertimbangkan sebagai alternatif transplantasi sumsum tulang untuk pengobatan penyakit darah yang parah, terutama pada anak-anak. Masalah klinis transplantasi sel darah tali pusat secara bertahap teratasi - sudah ada metode yang cukup efektif untuk mengumpulkan, memisahkan, dan mengkriopreservasi sel darah tali pusat, kondisi sedang disediakan untuk pembentukan bank darah tali pusat, dan metode untuk menguji sel berinti sedang ditingkatkan. Larutan gelatin 3% dan larutan pati hidroksi etil 6% harus dianggap optimal untuk pemisahan selama pengadaan sel punca hematopoietik darah tali pusat dalam skala besar saat membuat bank.

P. Perekhrestenko dan rekan penulis (2001) dengan tepat mencatat bahwa transplantasi sel punca darah tali pusat harus mengambil tempat yang semestinya dalam kompleks tindakan terapeutik untuk mengatasi depresi hematopoietik dari berbagai genesis, karena sel punca darah tali pusat memiliki sejumlah keuntungan signifikan, di antaranya yang paling penting adalah relatif sederhananya pengadaannya, tidak adanya risiko bagi donor, rendahnya kontaminasi sel neonatal dengan virus, dan biaya transplantasi yang relatif rendah. Beberapa penulis menunjukkan bahwa transplantasi sel darah tali pusat lebih jarang disertai dengan komplikasi yang terkait dengan reaksi graft-versus-host daripada transplantasi sel sumsum tulang, yang menurut pendapat mereka disebabkan oleh ekspresi antigen HLA-DR yang lemah pada sel darah tali pusat dan ketidakmatangannya. Namun, populasi utama sel berinti dalam darah tali pusat adalah limfosit T (sel CD3-positif), yang isinya sekitar 50%, yang 20% lebih sedikit daripada dalam darah tepi orang dewasa, tetapi perbedaan fenotipik dalam subpopulasi sel T dari sumber-sumber ini tidak signifikan.

Di antara faktor-faktor yang secara langsung memengaruhi tingkat kelangsungan hidup dalam transplantasi sel punca darah tali pusat, perlu diperhatikan usia pasien (hasil terbaik diamati pada penerima yang berusia satu hingga lima tahun), diagnosis dini penyakit dan bentuk leukemia (efektivitasnya secara signifikan lebih tinggi pada leukemia akut). Yang sangat penting adalah dosis sel darah tali pusat berinti, serta kompatibilitas HLA-nya dengan penerima. Bukan kebetulan bahwa analisis efektivitas klinis transplantasi HSC darah tali pusat dalam onkohematologi menunjukkan hasil pengobatan terbaik saat menggunakan transplantasi terkait: kelangsungan hidup bebas kambuh satu tahun dalam kasus ini mencapai 63%, sedangkan dengan transplantasi yang tidak terkait - hanya 29%.

Dengan demikian, keberadaan sejumlah besar sel punca dalam darah tali pusat dan kapasitas repopulasi yang tinggi dari sel punca hematopoietik neonatal memungkinkan mereka untuk digunakan untuk transplantasi alogenik pada pasien onkohematologi. Namun, perlu dicatat bahwa rekapitulasi hematopoiesis setelah transplantasi sel hematopoietik darah tali pusat "diperpanjang dalam waktu": pemulihan kandungan neutrofil dalam darah perifer biasanya diamati pada akhir minggu ke-6, dan trombositopenia biasanya menghilang setelah 6 bulan. Selain itu, ketidakmatangan sel hematopoietik darah tali pusat tidak mengecualikan konflik imunologis: penyakit graft-versus-host akut dan kronis yang parah diamati pada 23 dan 25% penerima, masing-masing. Kekambuhan leukemia akut pada akhir tahun pertama setelah transplantasi sel darah tali pusat dicatat pada 26% kasus.

[ 10 ], [ 11 ]