Sel punca hematopoietik dari kantung kuning telur

Jelas, berbagai potensi proliferatif dan diferensiasi sel punca hematopoietik ditentukan oleh kekhasan perkembangan ontogenetiknya, karena bahkan lokalisasi area utama hematopoiesis berubah pada manusia selama ontogenesis. Sel progenitor hematopoietik dari kantung kuning telur janin berkomitmen untuk pembentukan garis sel eritropoietik eksklusif. Setelah migrasi HSC primer ke hati dan limpa, spektrum garis komitmen meluas di lingkungan mikro organ-organ ini. Secara khusus, sel punca hematopoietik memperoleh kemampuan untuk menghasilkan sel garis keturunan limfoid. Pada periode prenatal, sel progenitor hematopoietik mencapai zona lokalisasi akhir dan mengisi sumsum tulang. Selama perkembangan intrauterin, darah janin mengandung sejumlah besar sel punca hematopoietik. Misalnya, pada minggu ke-13 kehamilan, kadar HSC mencapai 18% dari jumlah total sel darah mononuklear. Selanjutnya, penurunan progresif dalam kandungannya diamati, tetapi bahkan sebelum kelahiran, jumlah HSC dalam darah tali pusat hanya sedikit berbeda dari jumlahnya di sumsum tulang.

Menurut konsep klasik, perubahan alami dalam lokalisasi hematopoiesis selama perkembangan embrio mamalia dilakukan melalui migrasi dan pengenalan sel induk hematopoietik pluripoten ke dalam lingkungan mikro baru - dari kantung kuning telur ke hati, limpa, dan sumsum tulang. Karena pada tahap awal perkembangan embrio, jaringan hematopoietik mengandung sejumlah besar sel induk, yang jumlahnya berkurang seiring dengan pematangan janin, yang paling menjanjikan untuk memperoleh sel induk hematopoietik adalah jaringan hematopoietik hati embrio, yang diisolasi dari bahan yang digugurkan pada usia kehamilan 5-8 minggu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pertanyaan tentang asal usul sel induk hematopoietik

Tidak diragukan lagi bahwa pembentukan embrio eritrosit berasal dari pulau-pulau darah kantung kuning telur. Akan tetapi, potensi diferensiasi in vitro sel-sel hematopoietik kantung kuning telur sangat terbatas (sel-sel tersebut berdiferensiasi terutama menjadi eritrosit). Perlu dicatat bahwa transplantasi sel induk hematopoietik kantung kuning telur tidak mampu memulihkan hematopoiesis untuk waktu yang lama. Ternyata sel-sel ini bukanlah prekursor HSC dewasa. HSC sejati muncul lebih awal, pada minggu ke-3-5 perkembangan intrauterin, di zona pembentukan jaringan lambung dan endotelium pembuluh darah (paraaortic splanchnopleura, P-SP), serta di tempat aorta, gonad, dan ginjal primer - di mesonefros atau yang disebut wilayah AGM. Telah ditunjukkan bahwa sel-sel wilayah AGM merupakan sumber tidak hanya HSC, tetapi juga sel-sel endotel pembuluh darah, serta osteoklas yang terlibat dalam proses pembentukan jaringan tulang. Pada minggu ke-6 kehamilan, sel-sel progenitor hematopoietik awal dari daerah AGM berpindah ke hati, yang tetap menjadi organ hematopoietik utama janin hingga lahir.

Karena poin ini sangat penting dari sudut pandang transplantasi sel, masalah asal usul HSC dalam proses embriogenesis manusia layak untuk dipaparkan lebih rinci. Gagasan klasik bahwa sel induk hematopoietik mamalia dan burung berasal dari sumber ekstraembrionik didasarkan pada penelitian Metcalf dan Moore, yang merupakan orang pertama yang menggunakan metode kloning HSC dan keturunannya yang diisolasi dari kantung kuning telur. Hasil kerja mereka menjadi dasar teori migrasi, yang menurutnya HSC, yang pertama kali muncul di kantung kuning telur, secara berurutan mengisi organ hematopoietik sementara dan definitif saat lingkungan mikro yang sesuai terbentuk di dalamnya. Dengan demikian, sudut pandang ditetapkan bahwa pembentukan HSC, yang awalnya terlokalisasi di kantung kuning telur, berfungsi sebagai dasar seluler untuk hematopoiesis definitif.

Sel progenitor hematopoietik kantung kuning telur termasuk dalam kategori sel progenitor hematopoietik paling awal. Fenotipe mereka dijelaskan oleh rumus AA4.1+CD34+c-kit+. Tidak seperti sel induk hematopoietik sumsum tulang dewasa, mereka tidak mengekspresikan antigen Sca-1 dan molekul MHC. Tampaknya munculnya antigen penanda pada membran permukaan sel induk hematopoietik kantung kuning telur selama kultivasi sesuai dengan diferensiasi mereka selama perkembangan embrio dengan pembentukan garis hematopoietik yang berkomitmen: tingkat ekspresi antigen CD34 dan Thy-1 menurun, ekspresi CD38 dan CD45RA meningkat, dan molekul HLA-DR muncul. Dengan spesialisasi berikutnya secara in vitro yang diinduksi oleh sitokin dan faktor pertumbuhan, ekspresi antigen khusus untuk sel progenitor hematopoietik dari garis sel tertentu dimulai. Namun, hasil studi hematopoiesis embrionik pada perwakilan tiga kelas vertebrata (amfibi, burung, dan mamalia) dan, khususnya, analisis asal usul HSC yang bertanggung jawab atas hematopoiesis definitif dalam ontogenesis pascanatal, bertentangan dengan konsep klasik. Telah ditetapkan bahwa pada perwakilan semua kelas yang dipertimbangkan, dua wilayah independen tempat HSC muncul terbentuk selama embriogenesis. Wilayah "klasik" ekstraembrionik diwakili oleh kantung kuning telur atau analognya, sedangkan zona intraembrionik lokalisasi HSC yang baru-baru ini diidentifikasi mencakup mesenkim paraaorta dan wilayah AGM. Saat ini, dapat dikatakan bahwa pada amfibi dan burung, HSC definitif berasal dari sumber intraembrionik, sedangkan pada mamalia dan manusia, partisipasi HSC kantung kuning telur dalam hematopoiesis definitif belum dapat sepenuhnya dikecualikan.

Hematopoiesis embrionik di kantung kuning telur sebenarnya adalah eritropoiesis primer, yang ditandai dengan pelestarian nukleus pada semua tahap pematangan eritrosit dan sintesis hemoglobin tipe janin. Menurut data terbaru, gelombang eritropoiesis primer berakhir di kantung kuning telur pada hari ke-8 perkembangan embrio. Ini diikuti oleh periode akumulasi sel progenitor eritroid definitif - BFU-E, yang terbentuk secara eksklusif di kantung kuning telur dan pertama kali muncul pada hari ke-9 kehamilan. Pada tahap embriogenesis berikutnya, sel progenitor eritroid definitif - CFU-E, serta (!) sel mast dan CFU-GM sudah terbentuk. Ini adalah dasar untuk sudut pandang bahwa sel progenitor definitif muncul di kantung kuning telur, bermigrasi dengan aliran darah, menetap di hati dan dengan cepat memulai fase pertama hematopoiesis intraembrionik. Menurut konsep ini, kantung kuning telur dapat dianggap, di satu sisi, sebagai tempat eritropoiesis primer, dan di sisi lain, sebagai sumber pertama sel progenitor hematopoietik definitif dalam perkembangan embrio.

Telah ditunjukkan bahwa sel pembentuk koloni dengan potensi proliferatif tinggi dapat diisolasi dari kantung kuning telur sedini hari ke-8 kehamilan, yaitu, jauh sebelum penutupan sistem vaskular embrio dan kantung kuning telur. Selain itu, sel-sel dengan potensi proliferatif tinggi yang diperoleh dari kantung kuning telur secara in vitro membentuk koloni yang ukuran dan komposisi selulernya tidak berbeda dari parameter yang sesuai dari pertumbuhan kultur sel induk sumsum tulang. Pada saat yang sama, ketika transplantasi ulang sel pembentuk koloni dari kantung kuning telur dengan potensi proliferatif tinggi, secara signifikan lebih banyak sel pembentuk koloni anak dan sel progenitor multipotensi terbentuk daripada ketika menggunakan sel progenitor sumsum tulang hematopoiesis.

Kesimpulan akhir tentang peran sel punca hematopoietik kantung kuning telur dalam hematopoiesis definitif dapat diperoleh dari hasil penelitian di mana penulis memperoleh garis sel endotel kantung kuning telur (G166), yang secara efektif mendukung proliferasi sel-selnya dengan karakteristik fenotipik dan fungsional HSC (AA4.1+WGA+, kepadatan rendah dan sifat perekat lemah). Kandungan yang terakhir meningkat lebih dari 100 kali lipat ketika dikultur pada lapisan pengumpan sel C166 selama 8 hari. Makrofag, granulosit, megakariosit, sel blast dan monosit, serta sel prekursor limfosit B dan T diidentifikasi dalam koloni campuran yang tumbuh pada sublapisan sel C166. Sel kantung kuning telur yang tumbuh pada sublapisan sel endotel memiliki kemampuan untuk bereproduksi sendiri dan bertahan hingga tiga kali dalam percobaan penulis. Pemulihan hematopoiesis dengan bantuan mereka pada tikus dewasa dengan defisiensi imun gabungan berat (SCID) disertai dengan pembentukan semua jenis leukosit, serta limfosit T dan B. Namun, penulis dalam penelitian mereka menggunakan sel kantung kuning telur dari embrio berusia 10 hari, di mana sistem vaskular ekstra dan intraembrionik sudah tertutup, yang tidak memungkinkan kita untuk mengecualikan keberadaan HSC intraembrionik di antara sel kantung kuning telur.

Pada saat yang sama, analisis potensi diferensiasi sel hematopoietik tahap awal perkembangan, diisolasi sebelum penyatuan sistem vaskular kantung kuning telur dan embrio (8-8,5 hari kehamilan), mengungkapkan adanya prekursor sel T dan B di kantung kuning telur, tetapi tidak di tubuh embrio. Dalam sistem in vitro, dengan metode kultivasi dua tahap pada lapisan tunggal sel epitel dan subepitel timus, sel mononuklear kantung kuning telur berdiferensiasi menjadi limfosit T pra-T dan dewasa. Di bawah kondisi kultivasi yang sama, tetapi pada lapisan tunggal sel stroma hati dan sumsum tulang, sel mononuklear kantung kuning telur berdiferensiasi menjadi sel pra-B dan limfosit B IglVT-matur.

Hasil penelitian ini menunjukkan kemungkinan pengembangan sel sistem imun dari jaringan ekstraembrionik kantung kuning telur, dan pembentukan garis sel T dan B primer bergantung pada faktor lingkungan mikro stroma organ hematopoietik embrionik.

Penulis lain juga telah menunjukkan bahwa kantung kuning telur mengandung sel-sel dengan potensi diferensiasi limfoid, dan limfosit yang dihasilkan tidak berbeda dalam karakteristik antigenik dari yang ada pada hewan dewasa secara seksual. Telah ditetapkan bahwa sel-sel kantung kuning telur dari embrio berusia 8-9 hari mampu memulihkan limfopoiesis dalam timus atimosit dengan munculnya limfosit CD3+CD4+- dan CD3+CD8+- dewasa yang memiliki repertoar reseptor sel T yang terbentuk. Dengan demikian, timus dapat dihuni oleh sel-sel yang berasal dari ekstraembrionik, tetapi tidak mungkin untuk mengecualikan kemungkinan migrasi sel prekursor limfosit T awal dari sumber limfopoiesis intraembrionik ke dalam timus.

Pada saat yang sama, transplantasi sel hematopoietik kantung kuning telur ke penerima dewasa yang diradiasi tidak selalu menghasilkan repopulasi jangka panjang dari zona lokalisasi jaringan hematopoietik yang terkuras, dan sel kantung kuning telur in vitro membentuk koloni limpa yang jauh lebih sedikit daripada sel wilayah AGM. Dalam beberapa kasus, dengan menggunakan sel kantung kuning telur dari embrio berusia 9 hari, masih mungkin untuk mencapai repopulasi jangka panjang (hingga 6 bulan) jaringan hematopoietik pada penerima yang diradiasi. Para penulis percaya bahwa sel kantung kuning telur dengan fenotipe CD34+c-kit+ tidak hanya tidak berbeda dari sel-sel dari wilayah AGM dalam kemampuan mereka untuk mengisi kembali organ hematopoietik yang terkuras, tetapi juga memulihkan hematopoiesis secara lebih efektif, karena kantung kuning telur mengandung hampir 37 kali lebih banyak dari mereka.

Perlu dicatat bahwa percobaan tersebut menggunakan sel hematopoietik kantung kuning telur dengan antigen penanda sel induk hematopoietik (c-kit+ dan/atau CD34+ dan CD38+), yang disuntikkan langsung ke hati atau vena abdomen keturunan tikus betina yang menerima suntikan busulfan pada hari ke-18 kehamilan. Pada hewan yang baru lahir tersebut, mielopoiesis mereka sendiri ditekan tajam karena eliminasi sel induk hematopoietik yang disebabkan oleh busulfan. Setelah transplantasi sel induk hematopoietik kantung kuning telur, elemen yang terbentuk yang mengandung penanda donor - gliserofosfat dehidrogenase - terdeteksi dalam darah tepi penerima selama 11 bulan. Ditemukan bahwa HSC kantung kuning telur memulihkan kandungan sel garis keturunan limfoid, mieloid, dan eritroid dalam darah, timus, limpa, dan sumsum tulang, dan tingkat kimerisme lebih tinggi dalam kasus pemberian sel kantung kuning telur secara intrahepatik daripada pemberian intravena. Para penulis percaya bahwa HSC kantung kuning telur dari embrio tahap awal (hingga 10 hari) memerlukan interaksi awal dengan lingkungan mikro hematopoietik hati untuk berhasil mengisi organ hematopoietik penerima dewasa. Ada kemungkinan bahwa ada tahap perkembangan yang unik dalam embriogenesis, ketika sel kantung kuning telur, awalnya bermigrasi ke hati, kemudian memperoleh kemampuan untuk mengisi stroma organ hematopoietik penerima dewasa.

Dalam hal ini, perlu dicatat bahwa kimerisme sel sistem imun cukup sering diamati setelah transplantasi sel sumsum tulang ke penerima dewasa yang terkena radiasi - dalam darah penerima dewasa, sel-sel fenotipe donor ditemukan dalam jumlah yang cukup besar di antara limfosit B, T, dan granulosit penerima, yang berlanjut setidaknya selama 6 bulan.

Sel hematopoietik pada mamalia pertama kali dideteksi dengan metode morfologi pada hari ke-7 perkembangan embrio dan diwakili oleh pulau-pulau hematopoietik di dalam pembuluh kantung kuning telur. Namun, diferensiasi hematopoietik alami dalam kantung kuning telur terbatas pada eritrosit primer yang mempertahankan inti dan mensintesis hemoglobin janin. Namun demikian, secara tradisional diyakini bahwa kantung kuning telur berfungsi sebagai satu-satunya sumber HSC yang bermigrasi ke organ hematopoietik embrio yang sedang berkembang dan menyediakan hematopoiesis definitif pada hewan dewasa, karena munculnya HSC dalam tubuh embrio bertepatan dengan penutupan sistem vaskular kantung kuning telur dan embrio. Sudut pandang ini didukung oleh data bahwa sel kantung kuning telur, ketika dikloning secara in vitro, menghasilkan granulosit dan makrofag, dan secara in vivo - menjadi koloni limpa. Kemudian, dalam percobaan transplantasi, ditetapkan bahwa sel-sel hematopoietik kantung kuning telur, yang dalam kantung kuning telur itu sendiri hanya mampu berdiferensiasi menjadi eritrosit primer, dalam lingkungan mikro hati tikus SCID yang baru lahir dan dewasa, timus yang terkuras atau pengumpan stroma memperoleh kemampuan untuk mengisi kembali organ-organ hematopoietik dengan pemulihan semua garis hematopoietik bahkan pada hewan penerima dewasa. Pada prinsipnya, ini memungkinkan kita untuk mengklasifikasikannya sebagai HSC sejati - sebagai sel yang berfungsi pada periode pascanatal. Diasumsikan bahwa kantung kuning telur, bersama dengan wilayah AGM, berfungsi sebagai sumber HSC untuk hematopoiesis definitif pada mamalia, tetapi kontribusinya terhadap perkembangan sistem hematopoietik masih belum jelas. Makna biologis dari keberadaan dua organ hematopoietik dengan fungsi serupa dalam embriogenesis mamalia awal juga tidak jelas.

Pencarian jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini terus berlanjut. Secara in vivo, dimungkinkan untuk membuktikan keberadaan sel-sel yang memulihkan limfopoiesis di kantung kuning telur embrio berusia 8-8,5 hari pada tikus SCID yang diiradiasi secara subletal dengan defisiensi limfosit T dan B yang nyata. Sel-sel hematopoietik kantung kuning telur disuntikkan baik secara intraperitoneal maupun langsung ke jaringan limpa dan hati. Setelah 16 minggu, limfosit T TCR/CD34 CD4+ dan CD8+ serta limfosit B B-220+IgM+ yang diberi label dengan gen MHC antrx donor terdeteksi pada penerima. Pada saat yang sama, penulis tidak menemukan sel punca yang mampu memulihkan sistem imun tersebut dalam tubuh embrio berusia 8-8,5 hari.

Sel hematopoietik kantung kuning telur memiliki potensi proliferatif yang tinggi dan mampu bereproduksi sendiri secara in vitro dalam jangka waktu yang lama. Beberapa penulis mengidentifikasi sel-sel ini sebagai HSC berdasarkan pembentukan sel progenitor eritroid yang berlangsung lama (hampir 7 bulan), yang berbeda dari sel progenitor sumsum tulang dari garis keturunan eritroid dengan periode peralihan yang lebih lama, ukuran koloni yang lebih besar, peningkatan kepekaan terhadap faktor pertumbuhan, dan proliferasi yang lebih lama. Selain itu, dalam kondisi yang tepat dari pembudidayaan sel kantung kuning telur secara in vitro, sel progenitor limfoid juga terbentuk.

Data yang disajikan secara umum memungkinkan kita untuk mempertimbangkan kantung kuning telur sebagai sumber HSC, kurang berkomitmen dan karena itu memiliki potensi proliferatif yang lebih besar daripada sel induk sumsum tulang. Namun, terlepas dari kenyataan bahwa kantung kuning telur mengandung sel progenitor hematopoietik pluripoten yang mempertahankan berbagai garis diferensiasi hematopoietik in vitro untuk waktu yang lama, satu-satunya kriteria untuk kelengkapan HSC adalah kemampuannya untuk mengisi kembali organ hematopoietik penerima dalam jangka panjang, yang sel hematopoietiknya hancur atau cacat genetik. Dengan demikian, pertanyaan utamanya adalah apakah sel hematopoietik pluripoten dari kantung kuning telur dapat bermigrasi dan mengisi organ hematopoietik dan apakah disarankan untuk merevisi karya-karya yang diketahui yang menunjukkan kemampuannya untuk mengisi kembali organ hematopoietik hewan dewasa dengan pembentukan garis hematopoietik utama. Sumber intraembrionik GSC definitif telah diidentifikasi dalam embrio burung pada tahun 1970-an, yang kemudian menimbulkan keraguan pada gagasan yang sudah mapan tentang asal usul ekstraembrionik GSC, termasuk pada perwakilan kelas vertebrata lainnya. Dalam beberapa tahun terakhir, telah muncul publikasi tentang keberadaan area intraembrionik serupa yang mengandung GSC pada mamalia dan manusia.

Perlu dicatat sekali lagi bahwa pengetahuan mendasar di bidang ini sangat penting untuk transplantasi sel praktis, karena akan membantu tidak hanya untuk menentukan sumber HSC yang disukai, tetapi juga untuk menetapkan fitur interaksi sel hematopoietik primer dengan organisme asing secara genetik. Diketahui bahwa pengenalan sel induk hematopoietik dari hati janin manusia ke dalam embrio domba pada tahap organogenesis mengarah pada kelahiran hewan chimera, dalam darah dan sumsum tulang yang 3 hingga 5% sel hematopoietik manusia ditentukan secara stabil. Pada saat yang sama, HSC manusia tidak mengubah kariotipe mereka, mempertahankan tingkat proliferasi yang tinggi dan kemampuan untuk berdiferensiasi. Selain itu, HSC xenogenik yang ditransplantasikan tidak bertentangan dengan sistem kekebalan dan fagosit organisme inang dan tidak berubah menjadi sel tumor, yang menjadi dasar untuk pengembangan intensif metode untuk koreksi intrauterin patologi genetik herediter menggunakan HSC atau ESC yang ditransfeksi dengan gen yang kekurangan.

Tetapi pada tahap embriogenesis manakah koreksi semacam itu lebih tepat dilakukan? Untuk pertama kalinya, sel-sel yang ditentukan untuk hematopoiesis muncul pada mamalia segera setelah implantasi (hari ke-6 kehamilan), ketika tanda-tanda morfologis diferensiasi hematopoietik dan organ hematopoietik dugaan masih belum ada. Pada tahap ini, sel-sel embrio tikus yang tersebar mampu mengisi kembali organ hematopoietik penerima yang diradiasi dengan pembentukan eritrosit dan limfosit yang berbeda dari sel inang berdasarkan jenis hemoglobin atau gliserofosfat isomerase, masing-masing, serta penanda kromosom tambahan (Tb) dari sel donor. Pada mamalia, seperti pada burung, bersamaan dengan kantung kuning telur, sebelum penutupan dasar pembuluh darah umum, sel-sel hematopoietik muncul langsung di tubuh embrio di splanknopleura paraaorta. Sel hematopoietik dengan fenotipe AA4.1+ diisolasi dari daerah AGM dan dikarakterisasi sebagai sel hematopoietik multipoten yang membentuk limfosit T dan B, granulosit, megakariosit, dan makrofag. Secara fenotip, sel progenitor multipoten ini sangat dekat dengan HSC sumsum tulang hewan dewasa (CD34+c-kit+). Jumlah sel AA4.1+ multipoten di antara semua sel daerah AGM kecil - mereka hanya berjumlah tidak lebih dari 1/12 bagiannya.

Pada embrio manusia, daerah intraembrionik yang mengandung HSC yang homolog dengan daerah AGM hewan juga telah diidentifikasi. Selain itu, pada manusia, lebih dari 80% sel multipotensi dengan potensi proliferatif tinggi terdapat di dalam tubuh embrio, meskipun sel-sel tersebut juga terdapat di kantung kuning telur. Analisis terperinci tentang lokasinya menunjukkan bahwa ratusan sel tersebut terkumpul dalam kelompok kompak yang terletak di dekat endotelium dinding ventral aorta dorsal. Secara fenotip, mereka adalah sel CD34CD45+Lin. Sebaliknya, di kantung kuning telur, serta di organ hematopoietik embrio lainnya (hati, sumsum tulang), sel-sel tersebut bersifat tunggal.

Akibatnya, pada embrio manusia, daerah AGM mengandung gugusan sel hematopoietik yang terkait erat dengan endotelium ventral aorta dorsal. Kontak ini juga dilacak pada tingkat imunokimia - baik sel gugusan hematopoietik maupun sel endotel mengekspresikan faktor pertumbuhan endotel vaskular, ligan Flt-3, reseptornya FLK-1 dan STK-1, serta faktor transkripsi sel induk leukemia. Di daerah AGM, turunan mesenkimal diwakili oleh untaian padat sel bulat yang terletak di sepanjang aorta dorsal dan mengekspresikan tenascin C - glikoprotein zat dasar yang secara aktif terlibat dalam proses interaksi dan migrasi antarsel.

Sel punca multipotensi dari daerah AGM setelah transplantasi dengan cepat memulihkan hematopoiesis pada tikus dewasa yang diradiasi dan menyediakan hematopoiesis yang efektif untuk waktu yang lama (hingga 8 bulan). Penulis tidak menemukan sel dengan sifat seperti itu di kantung kuning telur. Hasil penelitian ini dikonfirmasi oleh data dari penelitian lain, yang menunjukkan bahwa pada embrio tahap awal perkembangan (10,5 hari), daerah AGM adalah satu-satunya sumber sel yang sesuai dengan definisi HSC, memulihkan hematopoiesis myeloid dan limfoid pada penerima dewasa yang diradiasi.

Garis stroma AGM-S3 diisolasi dari daerah AGM, sel-sel yang mendukung pembentukan sel progenitor yang berkomitmen CFU-GM, BFU-E, CFU-E dan unit pembentuk koloni tipe campuran dalam kultur. Kandungan yang terakhir selama kultivasi pada sublapisan pengumpan sel garis AGM-S3 meningkat dari 10 hingga 80 kali. Dengan demikian, lingkungan mikro daerah AGM mengandung sel-sel dasar stroma yang secara efektif mendukung hematopoiesis, sehingga daerah AGM sendiri dapat bertindak sebagai organ hematopoietik embrionik - sumber HSC definitif, yaitu, HSC yang membentuk jaringan hematopoietik hewan dewasa.

Imunofenotipe yang diperluas dari komposisi seluler daerah AGM menunjukkan bahwa daerah tersebut tidak hanya mengandung sel hematopoietik multipotensi, tetapi juga sel yang berkomitmen pada diferensiasi myeloid dan limfoid (limfosit T dan B). Namun, analisis molekuler sel CD34+c-kit+ individual dari daerah AGM menggunakan reaksi berantai polimerase mengungkapkan aktivasi hanya gen beta-globin dan mieloperoksidase, tetapi bukan gen limfoid yang mengkode sintesis CD34, Thy-1, dan 15. Aktivasi parsial gen spesifik garis keturunan merupakan karakteristik tahap ontogenetik awal dari pembentukan HSC dan sel progenitor. Mempertimbangkan bahwa jumlah sel progenitor yang berkomitmen di daerah AGM embrio 10 hari adalah 2-3 kali lipat lebih rendah daripada di hati, dapat dikatakan bahwa pada hari ke-10 embriogenesis, hematopoiesis di daerah AGM baru saja dimulai, sedangkan di organ hematopoietik utama janin selama periode ini, garis hematopoietik telah berkembang.

Memang, tidak seperti sel induk hematopoietik sebelumnya (9-11 hari) dari kantung kuning telur dan daerah AGM, yang mengisi kembali lingkungan mikro hematopoietik bayi baru lahir, tetapi tidak organisme dewasa, sel progenitor hematopoietik dari hati embrionik 12-17 hari tidak lagi memerlukan lingkungan mikro pascanatal awal dan mengisi organ hematopoietik hewan dewasa tidak lebih buruk dari bayi baru lahir. Setelah transplantasi HSC hati embrionik, hematopoiesis pada tikus penerima dewasa yang diradiasi memiliki karakter poliklonal. Selain itu, dengan menggunakan koloni berlabel, ditunjukkan bahwa fungsi klon yang dicangkok sepenuhnya bergantung pada suksesi klonal yang terungkap dalam sumsum tulang dewasa. Akibatnya, HSC hati embrionik, yang diberi label dalam kondisi yang paling lembut, tanpa pra-stimulasi dengan sitokin eksogen, sudah memiliki atribut utama HSC dewasa: mereka tidak memerlukan lingkungan mikro postembrionik awal, memasuki keadaan dormansi yang dalam setelah transplantasi, dan dimobilisasi ke dalam pembentukan klonal secara berurutan sesuai dengan model suksesi klonal.

Jelas, perlu untuk membahas fenomena suksesi klonal secara lebih rinci. Eritropoiesis dilakukan oleh sel induk hematopoietik yang memiliki potensi proliferatif tinggi dan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi semua lini sel prekursor sel darah yang berkomitmen. Pada intensitas hematopoiesis normal, sebagian besar sel induk hematopoietik berada dalam keadaan tidak aktif dan dimobilisasi untuk proliferasi dan diferensiasi, secara berurutan membentuk klon yang saling menggantikan. Proses ini disebut suksesi klonal. Bukti eksperimental suksesi klonal dalam sistem hematopoietik diperoleh dalam penelitian dengan HSC yang ditandai dengan transfer gen retrovirus. Pada hewan dewasa, hematopoiesis dipertahankan oleh banyak klon hematopoietik yang berfungsi secara bersamaan, turunan dari HSC. Berdasarkan fenomena suksesi klonal, pendekatan repopulasi untuk identifikasi HSC telah dikembangkan. Menurut prinsip ini, perbedaan dibuat antara sel punca hematopoietik jangka panjang (LT-HSC), yang mampu memulihkan sistem hematopoietik sepanjang hidup, dan HSC jangka pendek, yang melakukan fungsi ini untuk jangka waktu terbatas.

Jika kita mempertimbangkan sel induk hematopoietik dari sudut pandang pendekatan repopulasi, maka kekhasan sel hematopoietik hati embrionik adalah kemampuannya untuk membuat koloni yang ukurannya jauh lebih besar daripada yang ada dalam pertumbuhan HSC darah tali pusat atau sumsum tulang, dan ini berlaku untuk semua jenis koloni. Fakta ini sendiri menunjukkan potensi proliferasi sel hematopoietik hati embrionik yang lebih tinggi. Sifat unik sel progenitor hematopoietik hati embrionik adalah siklus sel yang lebih pendek dibandingkan dengan sumber lain, yang sangat penting dari sudut pandang efektivitas repopulasi organ hematopoietik selama transplantasi. Analisis komposisi seluler suspensi hematopoietik yang diperoleh dari sumber organisme dewasa menunjukkan bahwa pada semua tahap ontogenesis, sel nuklir sebagian besar diwakili oleh sel-sel yang berdiferensiasi akhir, yang jumlah dan fenotipenya bergantung pada usia ontogenetik donor jaringan hematopoietik. Secara khusus, suspensi sel mononuklear sumsum tulang dan darah tali pusat terdiri dari lebih dari 50% sel dewasa dari seri limfoid, sedangkan jaringan hematopoietik hati embrionik mengandung kurang dari 10% limfosit. Selain itu, sel-sel garis keturunan myeloid di hati embrionik dan janin diwakili terutama oleh seri eritroid, sedangkan dalam darah tali pusat dan sumsum tulang, elemen granulosit-makrofag mendominasi.

Penting juga bahwa hati embrionik mengandung satu set lengkap prekursor hematopoietik paling awal. Di antara yang terakhir, sel-sel pembentuk koloni eritroid, granulopoietik, megakariopoietik, dan multilineage harus diperhatikan. Prekursor mereka yang lebih primitif - LTC-IC - mampu berkembang biak dan berdiferensiasi secara in vitro selama 5 minggu atau lebih, dan juga mempertahankan aktivitas fungsional setelah pencangkokan dalam tubuh penerima selama transplantasi alogenik dan bahkan xenogenik pada hewan yang mengalami defisiensi imun.

Kemanfaatan biologis dari dominasi sel eritroid di hati embrionik (hingga 90% dari jumlah total elemen hematopoietik) disebabkan oleh kebutuhan untuk menyediakan volume darah janin yang berkembang dengan cepat dengan massa eritrosit. Di hati embrionik, eritropoiesis diwakili oleh prekursor eritroid nuklir dengan berbagai tingkat kematangan yang mengandung hemoglobin janin (a2u7), yang, karena afinitasnya yang lebih tinggi terhadap oksigen, memastikan penyerapan yang efektif dari yang terakhir dari darah ibu. Intensifikasi eritropoiesis di hati embrionik dikaitkan dengan peningkatan lokal dalam sintesis eritropoietin (EPO). Perlu dicatat bahwa keberadaan eritropoietin saja sudah cukup untuk mewujudkan potensi hematopoietik sel hematopoietik di hati embrionik, sedangkan kombinasi sitokin dan faktor pertumbuhan yang terdiri dari EPO, SCF, GM-CSF dan IL-3 diperlukan untuk komitmen HSC sumsum tulang dan darah tali pusat terhadap eritropoiesis. Pada saat yang sama, sel progenitor hematopoietik awal yang diisolasi dari hati embrionik, yang tidak memiliki reseptor untuk EPO, tidak merespons eritropoietin eksogen. Untuk induksi eritropoiesis dalam suspensi sel mononuklear hati embrionik, diperlukan keberadaan sel peka eritropoietin yang lebih maju dengan fenotipe CD34+CD38+, yang mengekspresikan reseptor EPO.

Dalam literatur, masih belum ada konsensus tentang perkembangan hematopoiesis pada periode embrionik. Signifikansi fungsional keberadaan sumber sel progenitor hematopoietik ekstra- dan intra-embrionik belum ditetapkan. Namun, tidak diragukan lagi bahwa dalam embriogenesis manusia, hati adalah organ utama hematopoiesis dan pada minggu ke-6 hingga ke-12 kehamilan berfungsi sebagai sumber utama sel induk hematopoietik yang mengisi limpa, timus, dan sumsum tulang. GDR memastikan kinerja fungsi yang sesuai dalam periode perkembangan pra dan pascanatal.

Perlu dicatat sekali lagi bahwa hati embrionik, dibandingkan dengan sumber lain, dicirikan oleh kandungan HSC tertinggi. Sekitar 30% sel CD344 hati embrionik memiliki fenotipe CD38. Pada saat yang sama, jumlah sel progenitor limfoid (CD45+) pada tahap awal hematopoiesis di hati tidak lebih dari 4%. Telah ditetapkan bahwa, seiring perkembangan janin, dari usia kehamilan 7 hingga 17 minggu, jumlah limfosit B meningkat secara progresif dengan "langkah" bulanan sebesar 1,1%, sementara tingkat HSC menurun secara permanen.

Aktivitas fungsional sel punca hematopoietik juga bergantung pada periode perkembangan embrionik sumbernya. Studi aktivitas pembentukan koloni sel hati embrio manusia pada usia kehamilan 6-8 dan 9-12 minggu selama kultivasi dalam media semi-cair dengan adanya SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 dan EPO menunjukkan bahwa jumlah total koloni 1,5 kali lebih tinggi saat menyemai HSC hati embrio pada tahap awal perkembangan. Pada saat yang sama, jumlah sel progenitor mielopoiesis seperti CFU-GEMM di hati pada usia embriogenesis 6-8 minggu lebih dari tiga kali lebih tinggi daripada jumlah mereka pada usia kehamilan 9-12 minggu. Secara umum, aktivitas pembentukan koloni sel hati hematopoietik embrio pada trimester pertama kehamilan secara signifikan lebih tinggi daripada sel hati janin pada trimester kedua kehamilan.

Data di atas menunjukkan bahwa hati embrionik pada awal embriogenesis dibedakan tidak hanya oleh peningkatan kandungan sel progenitor hematopoietik awal, tetapi sel hematopoietiknya dicirikan oleh spektrum diferensiasi yang lebih luas menjadi berbagai lini sel. Fitur-fitur aktivitas fungsional sel induk hematopoietik hati embrionik ini mungkin memiliki signifikansi klinis tertentu, karena karakteristik kualitatifnya memungkinkan kita untuk mengharapkan efek terapeutik yang nyata ketika mentransplantasikan bahkan sejumlah kecil sel yang diperoleh pada tahap awal kehamilan.

Meskipun demikian, masalah kuantitas sel punca hematopoietik yang diperlukan untuk transplantasi yang efektif masih terbuka dan relevan. Berbagai upaya dilakukan untuk menyelesaikannya dengan menggunakan potensi reproduksi diri yang tinggi dari sel-sel hematopoietik hati embrionik secara in vitro ketika distimulasi oleh sitokin dan faktor pertumbuhan. Dengan perfusi konstan HSC hati embrionik awal dalam bioreaktor, setelah 2-3 hari, dimungkinkan untuk memperoleh kuantitas sel punca hematopoietik pada keluaran yang 15 kali lebih tinggi dari tingkat awalnya. Sebagai perbandingan, perlu dicatat bahwa setidaknya diperlukan dua minggu untuk mencapai peningkatan 20 kali lipat dalam keluaran HSC darah tali pusat manusia dalam kondisi yang sama.

Dengan demikian, hati embrionik berbeda dari sumber sel induk hematopoietik lainnya dengan kandungan sel progenitor hematopoietik awal dan berkomitmen yang lebih tinggi. Dalam kultur dengan faktor pertumbuhan, sel hati embrionik dengan fenotipe CD34+CD45Ra1 CD71l0W membentuk koloni 30 kali lebih banyak daripada sel darah tali pusat yang serupa dan 90 kali lebih banyak daripada HSC sumsum tulang. Perbedaan yang paling menonjol dalam sumber yang ditentukan adalah pada kandungan sel progenitor hematopoietik awal yang membentuk koloni campuran - jumlah CFU-GEMM dalam hati embrionik melebihi yang ada dalam darah tali pusat dan sumsum tulang masing-masing sebanyak 60 dan 250 kali.

Penting juga bahwa hingga minggu ke-18 perkembangan embrio (periode dimulainya hematopoiesis di sumsum tulang), lebih dari 60% sel hati terlibat dalam pelaksanaan fungsi hematopoietik. Karena janin manusia tidak memiliki timus dan, karenanya, timosit hingga minggu ke-13 perkembangan, transplantasi sel hematopoietik dari hati embrio pada usia kehamilan 6-12 minggu secara signifikan mengurangi risiko mengembangkan reaksi "graft versus host" dan tidak memerlukan pemilihan donor histocompatibel, karena membuatnya relatif mudah untuk mencapai chimerisme hematopoietik.