Sel punca mesenkim

Di antara sel punca regional, tempat khusus ditempati oleh sel punca mesenkimal (MSC), yang turunannya membentuk matriks stroma semua organ dan jaringan tubuh manusia. Prioritas dalam penelitian MSC adalah milik perwakilan ilmu biologi Rusia.

Pada pertengahan abad lalu, kultur homogen sel punca stroma multipotensi sumsum tulang diisolasi untuk pertama kalinya di laboratorium A. Friedenstein. Sel punca mesenkimal yang menempel pada substrat mempertahankan intensitas proliferasi tinggi untuk waktu yang lama, dan dalam kultur dengan kepadatan penyemaian rendah setelah fiksasi pada substrat, mereka membentuk klon sel seperti fibroblas yang tidak memiliki aktivitas fagositosis. Penghentian proliferasi MSC berakhir dengan diferensiasi spontan mereka secara in vitro menjadi sel-sel tulang, lemak, tulang rawan, otot atau jaringan ikat. Penelitian lebih lanjut memungkinkan untuk menetapkan potensi osteogenik sel-sel seperti fibroblas dari stroma sumsum tulang berbagai spesies mamalia, serta aktivitas pembentukan koloni mereka. Percobaan in vivo telah menunjukkan bahwa transplantasi heterotopik dan ortotopik sel-sel seperti fibroblas pembentuk koloni menghasilkan pembentukan tulang, tulang rawan, jaringan fibrosa dan adiposa. Karena sel punca stroma sumsum tulang dicirikan oleh kapasitas tinggi untuk pembaruan diri dan diferensiasi multifaset dalam satu garis sel tunggal, mereka disebut sel progenitor mesenkimal multipotensi.

Perlu dicatat bahwa lebih dari 45 tahun penelitian mendasar mengenai sel punca mesenkimal, kondisi nyata telah diciptakan untuk penggunaan turunannya dalam praktik klinis.

Saat ini tidak diragukan lagi bahwa semua jaringan tubuh manusia terbentuk dari sel punca dari berbagai lini sel sebagai hasil dari proses proliferasi, migrasi, diferensiasi, dan pematangan. Akan tetapi, hingga saat ini diyakini bahwa sel punca pada organisme dewasa bersifat spesifik jaringan, yaitu mampu menghasilkan lini sel khusus hanya dari jaringan tempat sel tersebut berada. Posisi konseptual ini dibantah oleh fakta transformasi sel punca hematopoietik tidak hanya menjadi elemen seluler darah tepi, tetapi juga menjadi sel oval hati. Selain itu, sel punca saraf ternyata mampu menghasilkan neuron dan elemen glia, serta lini sel progenitor hematopoietik yang berkomitmen awal. Pada gilirannya, sel punca mesenkimal, yang biasanya menghasilkan elemen seluler tulang, tulang rawan, dan jaringan adiposa, mampu bertransformasi menjadi sel punca saraf. Diasumsikan bahwa dalam proses pertumbuhan, regenerasi jaringan fisiologis dan reparatif, sel progenitor yang tidak berkomitmen dihasilkan dari cadangan sel punca yang tidak spesifik jaringan. Misalnya, perbaikan jaringan otot dapat terjadi karena sel punca mesenkimal bermigrasi dari sumsum tulang ke otot rangka.

Meskipun pertukaran silang sel punca tersebut tidak diakui oleh semua peneliti, kemungkinan penggunaan klinis sel punca mesenkimal sebagai sumber transplantasi sel dan vektor seluler informasi genetik tidak lagi diperdebatkan oleh siapa pun, seperti halnya multipotensi sel punca stroma sumsum tulang, yang dapat diisolasi dan diperluas secara relatif mudah dalam kultur in vitro. Pada saat yang sama, laporan tentang potensi pluripotensi sel punca stroma sumsum tulang terus muncul dalam literatur ilmiah. Sebagai bukti, protokol penelitian dikutip di mana, di bawah pengaruh penginduksi transdiferensiasi tertentu, MSC diubah menjadi sel saraf, kardiomiosit, dan hepatosit. Namun, beberapa ilmuwan memiliki keraguan serius tentang kemungkinan aktivasi dan ekspresi gen yang berulang dari periode embriogenesis awal. Pada saat yang sama, setiap orang memahami bahwa jika kondisi ditemukan untuk memperluas multipotensi sel punca mesenkimal ke pluripotensi ESC, banyak masalah etika, moral, agama, dan hukum dalam pengobatan plastik regeneratif akan secara otomatis teratasi. Selain itu, karena dalam kasus ini sumber potensi sel induk regeneratif adalah sel stroma autologus pasien, masalah penolakan imun terhadap transplantasi sel juga terpecahkan. Masa depan yang dekat akan menunjukkan betapa realistisnya prospek ini.

[ 1 ], [ 2 ]

Penggunaan sel punca mesenkimal dalam pengobatan

Di klinik, penggunaan derivatif sel punca mesenkimal terutama dikaitkan dengan pemulihan kerusakan jaringan yang terjadi pada lesi kulit termal yang luas dan dalam. Pada tahap praklinis, penilaian eksperimental terhadap kelayakan penggunaan sel punca mesenkimal mirip fibroblas alogenik untuk mengobati luka bakar yang dalam telah dilakukan. Telah ditunjukkan bahwa sel punca mesenkimal mirip fibroblas sumsum tulang membentuk satu lapisan dalam kultur, yang memungkinkan transplantasi sel punca tersebut untuk mengoptimalkan proses regenerasi luka bakar yang dalam. Para penulis mencatat bahwa fibroblas embrionik memiliki sifat yang serupa, tetapi penggunaan klinisnya dibatasi oleh masalah etika dan hukum yang ada. Luka bakar termal yang dalam dengan kerusakan pada semua lapisan kulit dimodelkan pada tikus Wistar. Luas luka bakar adalah 18-20% dari total permukaan kulit. Kelompok eksperimen pertama meliputi tikus dengan luka bakar termal yang dalam dan transplantasi sel punca mesenkimal mirip fibroblas alogenik. Kelompok kedua terdiri dari hewan dengan luka bakar termal yang dalam dan transplantasi fibroblas embrionik alogenik. Kelompok ketiga diwakili oleh tikus kontrol dengan luka bakar termal dalam yang tidak menjalani terapi sel. Suspensi sel punca mesenkimal mirip fibroblas dan fibroblas embrionik dioleskan ke permukaan luka bakar menggunakan pipet dalam jumlah 2 x 10 ⁴sel pada hari ke-2 setelah pemodelan luka bakar dan eksisi keropeng nekrotik yang dihasilkan. Setelah transplantasi sel, permukaan luka bakar ditutup dengan kain kasa yang dibasahi dengan larutan natrium klorida isotonik dengan gentamisin. Sel sumsum tulang dikumpulkan untuk mendapatkan MSC dengan induksi berikutnya ke dalam garis sel punca mesenkimal seperti fibroblas dari tikus Wistar dewasa dari tulang paha. Fibroblas embrionik diperoleh dari paru-paru embrio berusia 14-17 hari. Fibroblas embrionik dan sel sumsum tulang untuk mendapatkan MSC dikulturkan terlebih dahulu dalam cawan Petri pada suhu 37°C dalam inkubator CO2, dalam atmosfer dengan 5% CO2 pada kelembaban 95%. Fibroblas embrionik dikulturkan selama 4-6 hari, sedangkan pembentukan satu lapis MSC membutuhkan waktu 14 hingga 17 hari. Selanjutnya, MSC dikriopreservasi sebagai bahan sumber untuk sel punca mesenkimal mirip fibroblas, yang diperoleh dengan cara mencairkan dan membudidayakan MSC selama 4 hari. Jumlah sel punca mesenkimal mirip fibroblas yang terbentuk lebih dari 3 kali lipat jumlah fibroblas embrionik yang terbentuk selama periode kultivasi yang sama. Untuk mengidentifikasi sel yang ditransplantasikan pada luka bakar pada tahap kultivasi, genomnya diberi label menggunakan vektor shuttle virus berdasarkan adenovirus tipe V rekombinan yang membawa gen 1ac-2 yang mengkode ß-galaktosidase E. coli. Sel hidup pada waktu yang berbeda setelah transplantasi dideteksi secara imunohistokimia dalam krioseseksi dengan penambahan substrat X-Gal, yang memberikan pewarnaan biru-hijau yang khas. Sebagai hasil dari penilaian visual, planimetrik, dan histologis yang dinamis terhadap kondisi luka bakar, ditetapkan bahwa pada hari ke-3 setelah transplantasi sel, perbedaan yang signifikan dalam perjalanan proses luka muncul pada kelompok yang dipilih. Perbedaan ini menjadi sangat jelas pada hari ke-7 setelah transplantasi sel. Pada hewan kelompok pertama, yang ditransplantasikan sel punca mesenkimal mirip fibroblas, luka memperoleh warna merah muda yang pekat secara seragam, jaringan granulasi tumbuh di seluruh areanya hingga ke tingkat epidermis, dan permukaan luka bakar berkurang secara signifikan. Lapisan kolagen yang terbentuk pada permukaan luka menjadi agak lebih tipis, tetapi terus menutupi seluruh area luka bakar. Pada hewan kelompok kedua, yang ditransplantasikan fibroblas embrionik, jaringan granulasi naik ke tingkat epidermis tepi luka, tetapi hanya di beberapa tempat, sementara plasmorea dari luka lebih intens daripada pada kelompok pertama, dan lapisan kolagen yang awalnya terbentuk praktis menghilang. Pada hewan yang tidak menerima terapi sel, pada hari ke-7 luka bakar berwarna pucat, berlubang, jaringan nekrotik yang ditutupi oleh fibrin. Plasmorea terlihat di seluruh permukaan luka bakar. Secara histologis, hewan kelompok pertama dan kedua menunjukkan penurunan infiltrasi seluler dan perkembangan jaringan vaskular,dan tanda-tanda proses regenerasi yang baru mulai ini lebih jelas terlihat pada tikus kelompok 1. Pada kelompok kontrol, tanda-tanda infiltrasi seluler pada luka diamati, pola histologis pembuluh darah yang baru terbentuk tidak ada. Pada hari ke 15-30 pengamatan, luas permukaan luka bakar pada hewan kelompok 1 secara signifikan lebih kecil daripada pada tikus kelompok lain, dan permukaan granulasi lebih berkembang. Pada hewan kelompok 2, luas permukaan luka bakar juga menurun dibandingkan dengan ukuran luka bakar pada tikus kelompok kontrol, yang terjadi karena epitelisasi marginal. Pada kelompok kontrol, permukaan luka bakar tetap pucat di tempat-tempat dengan granulasi langka, tanda bintang vaskular muncul di atasnya, ada pulau-pulau plak fibrinosa, plasmorea sedang berlanjut di seluruh permukaan luka bakar, dan keropeng yang sulit dipisahkan tetap ada di beberapa tempat. Secara umum, pada hewan kelompok ke-3, ukuran luka juga mengecil, tetapi tepi luka tetap terkikis.

Dengan demikian, selama studi perbandingan laju penyembuhan luka menggunakan sel punca mesenkimal mirip fibroblas dan fibroblas embrionik, serta tanpa penggunaan terapi sel, percepatan laju penyembuhan permukaan luka bakar dicatat sebagai hasil transplantasi sel punca mesenkimal mirip fibroblas dan fibroblas embrionik. Namun, dalam kasus penggunaan sel punca mesenkimal mirip fibroblas alogenik, laju penyembuhan luka lebih tinggi dibandingkan dengan transplantasi fibroblas embrionik. Hal ini dinyatakan dalam percepatan perubahan fase proses regeneratif - istilah infiltrasi seluler berkurang, laju pertumbuhan jaringan vaskular meningkat, serta pembentukan jaringan granulasi.

Hasil planimetri dinamis menunjukkan bahwa laju penyembuhan spontan luka bakar (tanpa penggunaan terapi sel) adalah yang terendah. Pada hari ke-15 dan ke-30 setelah transplantasi sel punca mesenkimal seperti fibroblas alogenik, laju penyembuhan luka lebih tinggi dibandingkan dengan transplantasi fibroblas embrionik. Metode histokimia untuk mendeteksi beta-galaktosidase menunjukkan bahwa setelah transplantasi sel punca mesenkimal seperti fibroblas dan fibroblas embrionik, sel-sel yang ditransplantasikan tetap hidup di permukaan dan di kedalaman luka regenerasi sepanjang seluruh periode pengamatan. Para penulis percaya bahwa laju regenerasi luka bakar yang lebih tinggi dengan penggunaan sel punca mesenkimal seperti fibroblas disebabkan oleh pelepasan faktor perangsang pertumbuhan yang aktif secara biologis oleh sel-sel ini selama proses pematangan.

Transplantasi keratinosit auto- atau alogenik dan fibroblas alogenik untuk pengobatan luka bakar juga telah digunakan dalam praktik klinis. Perlu dicatat bahwa perawatan bedah anak-anak dengan luka bakar yang dalam dan luas merupakan tugas yang rumit karena sifat traumatis yang tinggi dan berbagai intervensi bedah, kehilangan darah yang signifikan, dan berbagai reaksi terhadap media infus yang digunakan. Kesulitan utama dalam melakukan operasi plastik kulit untuk luka bakar yang dalam dan luas, dengan luas melebihi 40% dari permukaan tubuh, adalah karena tingkat keparahan kondisi korban dan kurangnya sumber daya kulit donor. Penggunaan transplantasi mesh dengan koefisien perforasi yang tinggi tidak menyelesaikan masalah, karena sel-sel yang terbentuk setelah perforasi mengalami epitelisasi sangat lambat, dan lipatan kulit itu sendiri sering kali mengalami lisis atau mengering. Penutup luka bakar seperti xenoskin, cangkok alo kadaver, penutup film sintetis tidak selalu cukup efektif, oleh karena itu metode baru untuk menutupi permukaan luka bakar dengan lapisan keratinosit dan fibroblas yang dikultur sedang dikembangkan. Secara khusus, metode untuk menutupi permukaan luka bakar dengan bantuan allofibroblast yang dikultur telah diusulkan, yang, ketika ditransplantasikan, memiliki efek stimulasi yang nyata pada proliferasi epidermosit yang diawetkan dalam luka pada luka bakar garis batas, serta keratinosit dalam septa transplantasi mesh. Karya L. Budkevich dan rekan penulis (2000) menyajikan hasil penggunaan metode ini untuk mengobati luka bakar pada anak-anak. Penelitian ini melibatkan 31 anak dengan trauma termal berusia 1 tahun hingga 14 tahun. Pada tiga anak, total luas luka bakar tingkat IIIA-B - IV adalah 40%, pada 25 - 50-70%, pada tiga lainnya - 71-85% dari permukaan tubuh. Nekrektomi bedah dini dikombinasikan dengan transplantasi allofibroblast yang dikultur dan autodermoplasti. Tahap pertama pengobatan melibatkan eksisi jaringan nekrotik, tahap kedua melibatkan transplantasi allofibroblast yang dikultur pada film pembawa, dan tahap ketiga (48 jam setelah transplantasi allofibroblast yang dikultur) melibatkan pengangkatan matriks dan autodermoplasti dengan flap kulit dengan rasio perforasi 1:4. Tiga pasien yang dirawat di klinik dengan penyakit luka bakar parah telah ditransplantasikan allofibroblast yang dikultur ke luka granulasi. Transplantasi allofibroblast yang dikultur dilakukan satu kali pada 18 anak, dua kali pada 11 anak, dan tiga kali pada dua pasien. Luas permukaan luka yang ditutupi dengan kultur sel berkisar antara 30 hingga 3500 cm2. Efektivitas allofibroblast yang dikultur dinilai dari persentase keseluruhan pencangkokan cangkok kulit, waktu penyembuhan luka bakar, dan jumlah kematian akibat trauma termal yang parah. Pencangkokan cangkok selesai pada 86% pasien. Tidak adanya pencangkokan kulit sebagian tercatat pada 14% kasus. Meskipun telah dilakukan perawatan, enam (19,3%) anak meninggal. Total luas kerusakan kulit berkisar antara 40 hingga 70% dari permukaan tubuh.Transplantasi alofibroblas yang dikultur tidak dikaitkan dengan mortalitas akibat cedera bakar pada pasien mana pun.

Menganalisis hasil perawatan, penulis mencatat bahwa kerusakan kulit termal yang sebelumnya dalam yang meliputi 35-40% dari permukaan tubuh dianggap tidak sesuai dengan kehidupan (untuk anak-anak yang lebih muda - hingga 3 tahun - luka bakar dalam yang meliputi 30% dari permukaan tubuh kritis, untuk anak-anak yang lebih tua - lebih dari 40% dari permukaan tubuh). Ketika melakukan nekrektomi bedah dengan transplantasi allofibroblast yang dikultur dan autodermoplasti berikutnya dengan flap kulit dengan koefisien perforasi yang tinggi, luka bakar derajat IIIB - IV tetap kritis, tetapi saat ini ada prospek untuk menyelamatkan nyawa bahkan korban tersebut dalam banyak kasus. Nekrektomi bedah dalam kombinasi dengan transplantasi allofibroblast yang dikultur dan autodermoplasti pada anak-anak dengan luka bakar yang dalam telah terbukti sangat efektif pada pasien dengan lesi kulit yang luas dengan kekurangan tempat donor. Taktik bedah aktif dan transplantasi alofibroblas yang dikultur berkontribusi pada stabilisasi cepat kondisi umum pasien tersebut, penurunan jumlah komplikasi infeksi penyakit luka bakar, terciptanya kondisi yang menguntungkan untuk pencangkokan transplantasi, pengurangan waktu pemulihan kulit yang hilang dan durasi perawatan rawat inap, penurunan frekuensi hasil fatal pada korban dengan luka bakar yang luas. Dengan demikian, transplantasi alofibroblas yang dikultur dengan autodermoplasti berikutnya dengan flap kulit memungkinkan pemulihan pada anak-anak dengan luka bakar parah, yang sebelumnya dianggap tidak akan bisa bertahan.

Secara umum diterima bahwa tujuan utama penanganan penyakit luka bakar adalah pemulihan kulit yang rusak secara menyeluruh dan cepat untuk mencegah efek toksik, komplikasi infeksi, dan dehidrasi. Hasil penggunaan sel kultur sangat bergantung pada kesiapan luka bakar itu sendiri untuk transplantasi. Dalam kasus transplantasi keratinosit kultur ke permukaan luka setelah nekrektomi bedah, rata-rata 55% (berdasarkan area) sel yang ditransplantasikan mengalami pencangkokan, sedangkan pada luka granulasi, tingkat pencangkokan menurun hingga 15%. Oleh karena itu, penanganan luka bakar kulit dalam yang luas dan berhasil memerlukan, pertama-tama, taktik bedah aktif. Pada luka bakar derajat IIIB-IV, permukaan luka bakar segera terbebas dari jaringan nekrotik untuk mengurangi keracunan dan mengurangi jumlah komplikasi penyakit luka bakar. Penggunaan taktik tersebut merupakan kunci untuk mengurangi waktu sejak menerima luka bakar hingga luka menutup dan lamanya perawatan pasien dengan luka bakar yang luas di rumah sakit, dan juga secara signifikan mengurangi jumlah kematian.

Laporan pertama tentang keberhasilan penggunaan keratinosit yang dikultur untuk menutupi permukaan luka bakar muncul pada awal tahun 1980-an. Selanjutnya, manipulasi ini dilakukan dengan menggunakan lapisan keratinosit yang dikultur, yang paling sering diperoleh dari autosel, lebih jarang dari allokeratinosit. Akan tetapi, teknologi autokeratinocytoplasty tidak memungkinkan pembuatan bank sel, sementara waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan transplantasi keratinosit dengan area yang cukup lama dan berjumlah 3-4 minggu. Selama periode ini, risiko timbulnya komplikasi infeksi dan komplikasi lain dari penyakit luka bakar meningkat tajam, yang secara signifikan memperpanjang total waktu rawat inap pasien di rumah sakit. Selain itu, autokeratinosit praktis tidak berakar saat ditransplantasikan ke luka bakar granulasi, dan tingginya biaya media pertumbuhan khusus dan stimulator pertumbuhan keratinosit yang aktif secara biologis secara signifikan membatasi penggunaan klinisnya. Metode bioteknologi lainnya, seperti kolagenoplasti, transplantasi xenoskin yang dikriopreservasi, dan penggunaan berbagai lapisan biopolimer meningkatkan efektivitas pengobatan luka bakar superfisial yang luas, tetapi tidak dalam. Metode pelapisan permukaan luka dengan fibroblas yang dikultur pada dasarnya berbeda karena fibroblas, bukan keratinosit, digunakan sebagai komponen utama lapisan sel yang dikultur.

Prasyarat untuk pengembangan metode ini adalah data bahwa perisit yang mengelilingi pembuluh darah kecil adalah sel-sel mesenkim progenitor yang mampu berubah menjadi fibroblas yang menghasilkan banyak faktor pertumbuhan dan memastikan penyembuhan luka karena efek stimulasi yang kuat pada proliferasi dan adhesi keratinosit. Penggunaan fibroblas yang dikultur untuk menutup permukaan luka segera mengungkapkan sejumlah keuntungan signifikan dari metode ini dibandingkan dengan penggunaan keratinosit yang dikultur. Secara khusus, mendapatkan fibroblas dalam kultur tidak memerlukan penggunaan media nutrisi khusus dan stimulan pertumbuhan, yang mengurangi biaya transplantasi lebih dari 10 kali lipat dibandingkan dengan biaya untuk mendapatkan keratinosit. Fibroblas mudah dipasivasi, di mana mereka kehilangan sebagian antigen histokompatibilitas permukaan, yang pada gilirannya membuka kemungkinan penggunaan sel-sel alogenik untuk pembuatan transplantasi dan pembuatan banknya. Waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan transplantasi yang siap digunakan di klinik berkurang dari 3 minggu (untuk keratinosit) menjadi 1-2 hari (untuk fibroblas). Kultur fibroblas primer dapat diperoleh dengan membudidayakan sel dari fragmen kulit yang diambil selama autodermoplasti, dan kepadatan penyemaian sel untuk memperoleh subkultur fibroblas manusia hanya 20 x 103 ^per 1 ^cm2.

Untuk mempelajari efek fibroblas dan protein pengaturnya terhadap proliferasi dan diferensiasi keratinosit, analisis komparatif morfologi dan proliferasi keratinosit pada substrat kolagen tipe I dan III, serta fibronektin dalam kultur gabungan dengan fibroblas manusia dilakukan. Keratinosit manusia diisolasi dari fragmen kulit pasien dengan luka bakar, yang diambil selama autodermoplasti. Kepadatan penyemaian keratinosit adalah 50 x 103 sel per 1 cm2. Kemanjuran klinis transplantasi fibroblas yang dikultur dinilai pada 517 pasien. Semua pasien dibagi menjadi dua kelompok: Kelompok 1 - korban dewasa dengan luka bakar IIA, B - derajat IV; Kelompok 2 - anak-anak dengan luka bakar dalam derajat IIIB - IV. Evaluasi dinamika organisasi struktural dan fungsional fibroblas kultur monolayer dengan mempertimbangkan peran glikosaminoglikan, fibronektin, dan kolagen dalam proses regenerasi memungkinkan penulis untuk menentukan hari ke-3 sebagai periode yang paling menguntungkan untuk menggunakan kultur fibroblas untuk membuat transplantasi. Sebuah studi tentang efek fibroblas pada proliferasi dan diferensiasi keratinosit menunjukkan bahwa fibroblas in vitro memiliki efek stimulasi yang nyata, terutama pada proses adhesi keratinosit, meningkatkan jumlah sel yang menempel dan laju fiksasinya lebih dari 2 kali lipat. Stimulasi proses adhesi disertai dengan peningkatan intensitas sintesis DNA dan tingkat proliferasi keratinosit. Selain itu, ternyata keberadaan fibroblas dan matriks ekstraseluler yang dibentuk olehnya merupakan kondisi yang diperlukan untuk pembentukan aparatus tonofibrilar keratinosit, koneksi antar sel dan, akhirnya, untuk diferensiasi keratinosit dan pembentukan membran basal. Dalam perawatan anak-anak dengan luka bakar yang dalam, efisiensi klinis yang tinggi dari transplantasi kultur allofibroblast telah ditetapkan, terutama pada kelompok pasien dengan lesi kulit yang luas dalam kondisi defisiensi situs donor. Sebuah studi morfofungsional yang komprehensif telah menunjukkan bahwa fibroblas transplantasi dicirikan oleh sintesis DNA yang aktif, serta kolagen, fibronektin dan glikosaminoglikan, yang merupakan bagian dari matriks ekstraseluler yang dibentuk oleh sel. Para penulis menunjukkan persentase pencangkokan fibroblas yang tinggi (hingga 96%), pengurangan tajam dalam waktu penerimaan mereka (dalam 24-48 jam, bukan 2-3 minggu dalam kasus penggunaan keratinosit), percepatan epitelisasi permukaan luka bakar yang signifikan, serta pengurangan biaya yang signifikan (sebesar 10 kali lipat) dari teknologi untuk menumbuhkan transplantasi dari fibroblas dibandingkan dengan transplantasi keratinosit. Penggunaan transplantasi allofibroblast yang dikultur memungkinkan untuk menyelamatkan nyawa anak-anak dengan luka bakar kritis - kerusakan termal pada lebih dari 50% permukaan tubuh,yang sebelumnya dianggap tidak sesuai dengan kehidupan. Perlu dicatat bahwa dengan transplantasi fibroblas embrionik alogenik, tidak hanya regenerasi luka yang lebih cepat dan pemulihan pasien dengan berbagai tingkat dan area luka bakar, tetapi juga pengurangan signifikan dalam mortalitas mereka juga telah terbukti secara meyakinkan.

Fibroblas autolog juga digunakan dalam bidang bedah plastik yang kompleks seperti koreksi rekonstruksi cedera pita suara. Kolagen sapi biasanya digunakan untuk tujuan ini, yang durasi kerjanya dibatasi oleh imunogenisitasnya. Sebagai protein asing, kolagen sapi sensitif terhadap kolagenase penerima dan dapat menyebabkan reaksi imun, untuk mengurangi risiko tersebut dikembangkan teknologi untuk memperoleh sediaan kolagen yang ditautkan silang dengan glutaraldehida. Keunggulannya terletak pada stabilitas yang lebih baik dan imunogenisitas yang lebih rendah, yang telah menemukan aplikasi praktis dalam menghilangkan cacat dan atrofi pita suara. Suntikan kolagen autolog pertama kali digunakan pada tahun 1995. Teknik ini memastikan pelestarian struktur primer serat kolagen autolog, termasuk ikatan silang yang dikatalisis secara enzimatik intramolekuler. Faktanya adalah bahwa serat kolagen alami lebih tahan terhadap kerusakan oleh protease daripada kolagen yang direkonstitusi, di mana telopeptida dipotong. Integritas telopeptida penting untuk struktur kuartener serat kolagen dan pembentukan ikatan silang antara molekul kolagen yang berdekatan. Tidak seperti sediaan kolagen sapi, kolagen autolog tidak menimbulkan reaksi imun pada penerima, tetapi tidak cukup efektif sebagai agen pengisian ulang. Koreksi yang stabil dapat dicapai melalui produksi kolagen lokal dengan transplantasi fibroblas autolog. Akan tetapi, kesulitan tertentu diidentifikasi selama studi efektivitas transplantasi fibroblas autolog di klinik. Pada periode awal setelah transplantasi fibroblas, efek klinisnya lebih lemah dibandingkan setelah pengenalan kolagen sapi. Ketika membudidayakan fibroblas autolog, kemungkinan transformasi fibroblas normal menjadi fibroblas patologis, yang disebut miofibroblas, yang bertanggung jawab atas perkembangan fibrosis dan pembentukan jaringan parut, sebagaimana dibuktikan oleh kontraksi gel kolagen yang disebabkan oleh interaksi spesifik fibroblas dan fibril kolagen, tidak dapat dikesampingkan. Selain itu, setelah pengoperan serial in vitro, fibroblas kehilangan kemampuan untuk mensintesis protein matriks ekstraseluler.

Akan tetapi, metode untuk membudidayakan fibroblas manusia autolog kini telah dikembangkan secara eksperimental yang menghilangkan kekurangan yang disebutkan di atas dan tidak mengakibatkan transformasi onkogenik fibroblas normal. Fibroblas autolog yang diperoleh menggunakan metode ini digunakan untuk memulihkan kerusakan pada jaringan lunak wajah. Dalam sebuah penelitian oleh G. Keller dkk. (2000), 20 pasien berusia 37 hingga 61 tahun dengan kerutan dan bekas luka atrofi diobati. Biopsi kulit (4 mm) dari daerah retroaurikular diangkut ke laboratorium dalam tabung reaksi steril yang berisi 10 ml media kultur (media Eagle dengan antibiotik, mikoseptik, piruvat, dan serum anak sapi janin). Bahan tersebut ditempatkan di dalam 3-5 cawan kultur berdiameter 60 mm dan diinkubasi dalam termostat dengan atmosfer yang mengandung 5% CO2. Setelah 1 minggu, sel dikeluarkan dari cawan dengan tripsinisasi dan ditempatkan dalam vial berukuran 25 cm2. Sel-sel disuntikkan ke pasien dalam jumlah 4 x 107. Efek klinis yang signifikan dan persisten diamati pada pasien selama koreksi lipatan nasolabial, serta pada pasien dengan bekas luka 7 dan 12 bulan setelah transplantasi ketiga fibroblas autolog. Menurut flow cytometry, fibroblas yang dikultur menghasilkan sejumlah besar kolagen tipe I. Studi in vitro telah menunjukkan kontraktilitas normal dari fibroblas yang disuntikkan. Dua bulan setelah pemberian fibroblas yang dikultur secara subkutan dengan dosis 4 x 107 sel, tidak ada tumor yang terdeteksi pada tikus nude. Fibroblas yang disuntikkan tidak menyebabkan jaringan parut atau fibrosis difus pada pasien. Menurut penulis, fibroblas autolog yang dicangkok mampu memproduksi kolagen secara konstan, yang akan memberikan efek peremajaan kosmetik. Pada saat yang sama, karena umur sel-sel yang berdiferensiasi terbatas, fibroblas yang diambil dari pasien muda lebih efektif daripada yang diperoleh dari orang tua. Di masa mendatang, diasumsikan bahwa kultur fibroblas yang diambil dari donor muda dapat dikriopreservasi untuk kemudian ditransplantasikan ke pasien lanjut usia. Sebagai kesimpulan, tidak sepenuhnya benar untuk menyimpulkan bahwa fibroblas autologus, asalkan diawetkan secara fungsional, merupakan cara ideal untuk memperbaiki kerusakan jaringan lunak wajah. Pada saat yang sama, penulis sendiri mencatat bahwa beberapa situasi bermasalah terkait penggunaan sistem kolagen-fibroblas autologus muncul selama penelitian. Efek klinisnya sering kali lebih lemah dibandingkan saat menggunakan kolagen sapi, yang menyebabkan kekecewaan pada pasien.

Secara umum, data literatur tentang prospek penggunaan klinis sel punca mesenkimal tampak cukup optimis. Berbagai upaya sedang dilakukan untuk menggunakan sel progenitor mesenkimal multipotensi sumsum tulang autologus guna mengobati lesi sendi degeneratif. Uji klinis pertama penggunaan sel progenitor mesenkimal yang dikultur dalam pengobatan fraktur tulang kompleks sedang dilakukan. Sel stroma sumsum tulang mesenkimal auto dan alogenik digunakan untuk membuat jaringan tulang rawan untuk transplantasi dalam koreksi defek tulang rawan artikular akibat trauma atau lesi autoimun. Berbagai metode sedang dikembangkan untuk penggunaan klinis sel progenitor mesenkimal multipotensi guna menghilangkan defek tulang pada anak-anak dengan bentuk osteogenesis tidak lengkap yang parah yang disebabkan oleh mutasi pada gen kolagen tipe I. Setelah mieloablasi, anak-anak penerima ditransplantasikan dengan sumsum tulang dari donor sehat yang kompatibel dengan HLA, karena sumsum tulang yang tidak terfraksinasi dapat mengandung sejumlah sel punca mesenkimal yang cukup untuk mengkompensasi defek tulang yang parah. Setelah transplantasi sumsum tulang alogenik, anak-anak tersebut telah menunjukkan perubahan histologis positif pada tulang trabekular, peningkatan laju pertumbuhan, dan penurunan kejadian patah tulang. Dalam beberapa kasus, hasil klinis positif dicapai dengan transplantasi sumsum tulang alogenik dan osteoblas yang terkait erat. Transplantasi MSC juga digunakan untuk mengobati kerapuhan tulang bawaan yang disebabkan oleh ketidakseimbangan osteoblas dan osteoklas dalam jaringan tulang. Dalam kasus ini, pemulihan pembentukan tulang dicapai melalui kimerisasi kumpulan sel stroma induk dan progenitor dalam jaringan tulang pasien.

Peningkatan metode modifikasi genetik sel punca mesenkimal donor untuk tujuan koreksi defek genetik jaringan stroma terus dilakukan. Diasumsikan bahwa dalam waktu dekat sel progenitor mesenkimal akan digunakan dalam neurologi untuk kimerisasi sel otak yang ditargetkan dan penciptaan kumpulan sel sehat yang mampu menghasilkan enzim atau faktor yang kurang bertanggung jawab atas manifestasi klinis penyakit. Transplantasi sel punca mesenkimal dapat digunakan untuk pemulihan stroma sumsum tulang pada pasien kanker setelah radioterapi dan kemoterapi, dan dalam kombinasi dengan sel sumsum tulang - untuk pemulihan hematopoiesis. Pengembangan terapi penggantian yang ditujukan untuk menghilangkan defek sistem muskuloskeletal dengan bantuan MSC dipromosikan oleh perkembangan rekayasa di bidang perancangan biomaterial matriks atau biomimetik yang membentuk kerangka kerja yang diisi oleh keturunan sel punca mesenkimal.

Sumber sel punca mesenkimal

Sumber utama sel punca mesenkimal adalah sumsum tulang, yang sel punca hematopoietiknya dalam tubuh mamalia terus berdiferensiasi menjadi sel darah dan sistem imun, sedangkan sel punca mesenkimal diwakili oleh populasi kecil sel mirip fibroblas dari stroma sumsum tulang dan berkontribusi pada pelestarian keadaan sel punca hematopoietik yang tidak berdiferensiasi. Dalam kondisi tertentu, sel punca mesenkimal berdiferensiasi menjadi sel tulang rawan dan jaringan tulang. Ketika disemai pada media kultur dalam kondisi penanaman kepadatan rendah, sel stroma mononuklear dari sumsum tulang membentuk koloni sel adhesif, yang sebenarnya adalah sel progenitor mesenkimal multipotensi seperti fibroblas. Beberapa penulis percaya bahwa sel punca mesenkimal yang tidak terikat disimpan di sumsum tulang, yang, karena kemampuannya untuk memperbarui diri dan potensi diferensiasi yang tinggi, menyediakan semua jaringan tubuh dengan prekursor mesenkimal dari elemen stroma sepanjang kehidupan organisme mamalia.

Di sumsum tulang, elemen seluler stroma membentuk jaringan yang mengisi ruang antara sinusoid dan jaringan tulang. Kandungan MSC dorman di sumsum tulang orang dewasa sebanding dengan jumlah sel punca hematopoietik dan tidak melebihi 0,01-0,001%. Sel punca mesenkimal yang diisolasi dari sumsum tulang dan tidak mengalami kultivasi tidak memiliki molekul adhesi. MSC tersebut tidak mengekspresikan CD34, ICAM, VCAM, kolagen tipe I dan III, CD44 dan CD29. Akibatnya, secara in vitro, bukan sel punca mesenkimal yang difiksasi pada substrat kultur, tetapi turunan progenitor sel punca mesenkimal yang lebih maju yang telah membentuk komponen sitoskeleton dan aparatus reseptor molekul adhesi sel. Sel stroma dengan fenotipe CD34 ditemukan bahkan dalam darah tepi, meskipun di sumsum tulang jumlahnya jauh lebih sedikit daripada sel mononuklear positif CD34. Sel CD34 yang diisolasi dari darah dan dipindahkan ke kultur menempel pada substrat dan membentuk koloni sel mirip fibroblas.

Diketahui bahwa pada periode embrionik, basis stroma semua organ dan jaringan mamalia dan manusia muncul dari kumpulan umum sel punca mesenkimal sebelum dan pada tahap organogenesis. Oleh karena itu, diyakini bahwa pada organisme dewasa, sebagian besar sel punca mesenkimal harus berada di jaringan ikat dan tulang. Telah ditetapkan bahwa bagian utama dari elemen seluler stroma jaringan ikat longgar dan jaringan tulang diwakili oleh sel progenitor yang berkomitmen, yang, bagaimanapun, mempertahankan kemampuan untuk berkembang biak dan membentuk klon secara in vitro. Ketika sel-sel tersebut dimasukkan ke dalam aliran darah umum, lebih dari 20% sel progenitor mesenkimal ditanamkan di antara elemen stroma jaringan hematopoietik dan organ parenkim.

Sumber potensial sel punca mesenkimal adalah jaringan adiposa, di antara sel punca tersebut prekursor adiposit yang telah diidentifikasi dalam berbagai tingkatan. Elemen progenitor jaringan adiposa yang paling tidak matang adalah sel stroma-vaskular, yang, seperti sel prekursor mesenkimal multipotensi sumsum tulang, mampu berdiferensiasi menjadi adiposit di bawah pengaruh glukokortikoid, faktor pertumbuhan mirip insulin, dan insulin. Dalam kultur, sel stroma-vaskular berdiferensiasi menjadi adiposit dan kondrosit, dan dalam jaringan adiposa yang berasal dari sumsum tulang terdapat sel yang membentuk adiposit dan osteoblas.

Sel induk stroma juga telah ditemukan di otot. Dalam kultur primer sel yang diisolasi dari otot rangka manusia, sel stellate dan miotube berinti banyak terdeteksi. Dengan adanya serum kuda, sel stellate berkembang biak secara in vitro tanpa tanda-tanda sitodiferensiasi, dan setelah penambahan deksametason ke media nutrisi, diferensiasinya ditandai dengan munculnya elemen seluler dengan fenotipe sel otot rangka dan otot polos, tulang, tulang rawan, dan jaringan adiposa. Oleh karena itu, baik sel progenitor mesenkim multipotensi yang berkomitmen maupun yang tidak berkomitmen hadir dalam jaringan otot manusia. Telah ditunjukkan bahwa populasi sel progenitor yang hadir dalam otot rangka berasal dari sel progenitor mesenkim multipotensi yang tidak berkomitmen dari sumsum tulang dan berbeda dari sel satelit miogenik.

Sel stellata adhesif yang sesuai dengan sel progenitor mesenkimal multipotensi dalam potensi diferensiasi juga ditemukan dalam miokardium tikus yang baru lahir, karena di bawah pengaruh deksametason, sel-sel ini berdiferensiasi menjadi adiposit, osteoblas, kondrosit, sel otot polos, miotube otot rangka, dan kardiomiosit. Telah ditunjukkan bahwa sel otot polos vaskular (perisit) merupakan turunan dari sel progenitor mesenkimal multipotensi perivaskular yang tidak berdiferensiasi. Dalam kultur, sel punca mesenkimal perivaskular mengekspresikan aktin-a otot polos dan reseptor faktor pertumbuhan yang berasal dari trombosit dan mampu berdiferensiasi setidaknya menjadi sel otot polos.

Tempat khusus, dari sudut pandang cadangan sel induk, ditempati oleh jaringan tulang rawan, yang potensi reparatifnya yang sangat rendah diyakini disebabkan oleh kekurangan sel progenitor mesenkimal multipotensi atau faktor diferensiasi dan pertumbuhan. Diasumsikan bahwa sel progenitor mesenkimal multipotensi yang telah berkomitmen sebelumnya terhadap kondrogenesis dan osteogenesis memasuki jaringan tulang rawan dari sumber jaringan lain.

Asal jaringan dan kondisi komitmen sel progenitor mesenkimal dalam tendon juga belum ditetapkan. Pengamatan eksperimental menunjukkan bahwa pada periode pascanatal awal, sel tendon Achilles kelinci dalam kultur primer dan pada bagian pertama mempertahankan ekspresi kolagen tipe I dan dekorin, tetapi dengan kultivasi lebih lanjut mereka kehilangan penanda diferensiasi tenosit.

Perlu dicatat bahwa jawaban atas pertanyaan apakah sel-sel progenitor mesenkimal multipotensi yang terlokalisasi di berbagai jaringan benar-benar selalu ada dalam stromanya, atau apakah kumpulan jaringan sel punca mesenkimal diisi ulang oleh migrasi sel punca stroma sumsum tulang, belum diterima.

Selain sumsum tulang dan zona jaringan mesenkimal lain dari organisme dewasa, darah tali pusat dapat menjadi sumber MSC lainnya. Telah ditunjukkan bahwa darah vena tali pusat mengandung sel-sel yang memiliki karakteristik morfologi dan antigenik yang mirip dengan sel progenitor mesenkimal multipotensi, mampu beradhesi dan tidak kalah dengan sel progenitor mesenkimal multipotensi asal sumsum tulang dalam potensi diferensiasi. Dalam kultur sel punca mesenkimal darah tali pusat, ditemukan 5 hingga 10% sel progenitor mesenkimal multipotensi yang tidak terikat. Ternyata jumlah mereka dalam darah tali pusat berbanding terbalik dengan usia kehamilan, yang secara tidak langsung menunjukkan migrasi sel progenitor mesenkimal multipotensi ke berbagai jaringan selama perkembangan janin. Informasi pertama telah muncul mengenai penggunaan klinis sel punca mesenkimal yang diisolasi dari darah tali pusat, serta sel punca yang diperoleh dari biomaterial embrionik, yang didasarkan pada kemampuan sel punca janin yang diketahui untuk berintegrasi, mencangkok, dan berfungsi dalam organ dan sistem jaringan penerima dewasa.

Pencarian sumber baru sel punca mesenkimal

Penggunaan sel punca mesenkimal asal embrionik, serta sel janin lainnya, menimbulkan sejumlah masalah etika, hukum, peradilan, dan perundang-undangan. Oleh karena itu, pencarian bahan sel donor ekstraembrionik terus berlanjut. Upaya penggunaan klinis fibroblas kulit manusia tidak berhasil, yang ditentukan sebelumnya tidak hanya oleh kapasitas finansial teknologi yang tinggi, tetapi juga oleh diferensiasi fibroblas yang cepat menjadi fibrosit, yang memiliki potensi proliferasi yang jauh lebih rendah dan menghasilkan sejumlah faktor pertumbuhan yang terbatas. Kemajuan lebih lanjut dalam studi biologi MSC dan sel progenitor mesenkimal multipotensi sumsum tulang memungkinkan kami untuk mengembangkan strategi untuk penggunaan klinis sel punca mesenkimal autologus. Teknologi isolasi, kultivasi, reproduksi eks vivo, dan diferensiasi tertarget memerlukan, pertama-tama, studi spektrum penanda molekuler MSC. Analisis mereka menunjukkan bahwa kultur primer jaringan tulang manusia mengandung beberapa jenis sel progenitor mesenkimal multipotensi. Fenotipe proosteoblas terdeteksi pada sel yang mengekspresikan penanda sel progenitor stroma STRO-1, tetapi tidak membawa penanda osteoblas - alkali fosfatase. Sel-sel tersebut dicirikan oleh kemampuan rendah untuk membentuk matriks tulang mineralisasi, serta tidak adanya ekspresi reseptor osteopontin dan hormon paratiroid. Turunan sel STRO-1-positif yang tidak mengekspresikan alkali fosfatase diwakili oleh osteoblas yang berdiferensiasi sedang dan lengkap. Ditemukan bahwa elemen seluler dari garis kloning sel tulang trabekular manusia STRO-1-positif mampu berdiferensiasi menjadi osteosit dan adiposit dewasa. Arah diferensiasi sel-sel ini bergantung pada efek asam lemak tak jenuh ganda, sitokin proinflamasi - IL-1b dan faktor nekrosis tumor a (TNF-a), serta TGF-b antiinflamasi dan imunosupresif.

Kemudian ditemukan bahwa sel progenitor mesenkimal multipotensi tidak memiliki fenotipe spesifik yang hanya melekat pada mereka, tetapi mengekspresikan kompleks penanda karakteristik sel mesenkimal, endotel, epitel dan otot tanpa adanya ekspresi antigen imunofenotipik sel hematopoietik - CD45, CD34 dan CD14. Selain itu, sel punca mesenkimal secara konstitutif dan induksibel menghasilkan faktor pertumbuhan hematopoietik dan non-hematopoietik, interleukin dan kemokin, dan reseptor untuk beberapa sitokin dan faktor pertumbuhan diekspresikan pada sel progenitor mesenkimal multipotensi. Sel dorman, atau istirahat, dengan imunofenotipe yang hampir identik dengan profil antigen sel progenitor mesenkimal multipotensi yang tidak diobati dengan 5-fluorourasil telah ditemukan di antara sel-sel matriks stroma tubuh manusia - kedua sel mengekspresikan CD117, yang menandai sel punca "dewasa".

Dengan demikian, penanda sel yang unik untuk sel punca mesenkimal belum teridentifikasi. Diasumsikan bahwa sel-sel yang tidak aktif mewakili populasi sel progenitor mesenkimal multipotensi yang tidak berkomitmen, karena mereka tidak mengekspresikan penanda sel yang berkomitmen untuk osteo- (Cbfa-1) atau adipogenesis (PPAR-y-2). Paparan sel-sel yang tidak aktif yang berproliferasi lambat dalam jangka panjang terhadap serum sapi janin menyebabkan pembentukan progenitor berkomitmen yang berdiferensiasi secara terminal yang ditandai dengan pertumbuhan yang cepat. Ekspansi klonal sel-sel punca mesenkimal tersebut didukung oleh FGF2. Tampaknya genom sel punca stroma cukup "tertutup" dengan rapat. Ada laporan tentang tidak adanya diferensiasi spontan dalam MSC - tanpa kondisi khusus untuk komitmen, mereka tidak berubah bahkan menjadi sel-sel dari garis keturunan mesenkimal.

Untuk mempelajari struktur populasi turunan sel punca mesenkimal, pencarian protein penanda diferensiasi dilakukan pada lini sel stroma dan dalam kultur primer. Analisis klonal in vitro dari sel pembentuk koloni sumsum tulang telah menunjukkan bahwa EGF meningkatkan ukuran koloni rata-rata dan menurunkan ekspresi klonal alkali fosfatase ketika diterapkan pada kultur primer, sementara penambahan hidrokortison mengaktifkan ekspresi alkali fosfatase, yang merupakan penanda arah osteogenik diferensiasi MSC. Antibodi monoklonal terhadap STRO-1 memungkinkan untuk memisahkan dan mempelajari populasi sel adhesif STRO-1-positif dalam sistem kultur Dexter yang heterogen. Spektrum sitokin telah ditentukan yang mengatur tidak hanya proliferasi dan diferensiasi sel hematopoietik dan limfoid, tetapi juga berpartisipasi dalam pembentukan, pembentukan dan resorpsi jaringan rangka melalui mekanisme para-, auto- dan endokrin. Pelepasan pembawa pesan sekunder yang dimediasi reseptor seperti cAMP, diacylglycerol, inositol triphosphate, dan Ca2+ juga digunakan untuk analisis penanda berbagai kategori sel jaringan stroma yang mengekspresikan reseptor yang sesuai. Penggunaan antibodi monoklonal sebagai penanda memungkinkan untuk menetapkan milik sel retikuler stroma organ limfoid ke zona yang bergantung pada T dan B.

Selama beberapa waktu, perdebatan ilmiah terus berlanjut seputar pertanyaan tentang kemungkinan asal MSC dari sel induk hematopoietik. Memang, ketika suspensi sel sumsum tulang dieksplantasikan ke dalam kultur monolayer, koloni fibroblas yang terpisah tumbuh di dalamnya. Namun, telah ditunjukkan bahwa keberadaan prekursor koloni fibroblas dan berbagai tunas diferensiasi jaringan hematopoietik di sumsum tulang bukanlah bukti asal usul yang sama dari sel induk hematopoietik. Dengan menggunakan analisis diskriminan sel induk sumsum tulang, ditetapkan bahwa lingkungan mikro selama transplantasi sumsum tulang heterotopik tidak ditransfer oleh sel hematopoietik, yang membuktikan keberadaan populasi MSC di sumsum tulang yang secara histogenetik independen dari sel hematopoietik.

Selain itu, metode kloning selektif memungkinkan untuk mengidentifikasi kategori baru sel progenitor stroma dalam kultur monolayer sel sumsum tulang, menentukan jumlahnya, dan mempelajari sifat-sifatnya, potensi proliferatif dan diferensiasinya. Ternyata sel-sel seperti fibroblas stroma berkembang biak secara in vitro dan membentuk koloni diploid, yang, ketika ditransplantasikan kembali ke dalam tubuh, menyediakan pembentukan organ hematopoietik baru. Hasil studi klon individu menunjukkan bahwa di antara sel-sel progenitor stroma ada populasi sel yang, dengan potensi proliferatif dan diferensiasinya, dapat mengklaim peran sel induk jaringan stroma, secara histogenetik independen dari sel induk hematopoietik. Sel-sel populasi ini dicirikan oleh pertumbuhan yang berkelanjutan dan berdiferensiasi menjadi elemen sel progenitor tulang, tulang rawan, dan jaringan retikuler sumsum tulang.

Yang sangat menarik adalah hasil penelitian oleh R. Chailakhyan dan rekan penulis (1997-2001), yang membudidayakan sel progenitor stroma sumsum tulang dari kelinci, marmut, dan tikus pada media nutrisi a-MEM dengan penambahan serum anak sapi fetus. Para penulis melakukan eksplantasi dengan kepadatan awal 2-4 x 103 sel sumsum tulang per 1 cm2. Sel sumsum tulang homolog atau heterolog yang diinaktivasi radiasi digunakan sebagai feeder dalam dosis yang mempertahankan efek feeder tetapi sepenuhnya memblokir proliferasi mereka. Koloni diskret primer fibroblas berumur dua minggu ditripsinasi untuk mendapatkan galur monoklonal. Bukti asal klonal koloni diperoleh dengan menggunakan penanda kromosom dalam kultur sumsum tulang campuran marmut jantan dan betina, fotografi time-lapse dari kultur hidup, dan dalam kultur campuran sumsum tulang singeneik tikus CBA dan CBAT6T6. Transplantasi suspensi sel sumsum tulang yang baru diisolasi atau fibroblas stroma yang tumbuh secara in vitro di bawah kapsul ginjal dilakukan dalam perancah berpori ivalon atau gelatin, serta matriks tulang spons kelinci yang dinonaktifkan. Untuk transplantasi klon dalam selubung tulang, tulang paha marmut dibersihkan dari jaringan lunak dan periosteum, epifisis dipangkas, dan sumsum tulang dicuci bersih. Tulang dipotong menjadi fragmen (3-5 mm), dikeringkan, dan diradiasi dengan dosis 60 Gy. Koloni fibroblas individu ditempatkan ke dalam selubung tulang dan ditanamkan secara intramuskular. Untuk transplantasi intraperitoneal fibroblas stroma yang tumbuh secara in vitro, ruang difusi tipe A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) dan O (V=0,15 cm3, h=2 mm) digunakan.

Ketika mempelajari dinamika pertumbuhan galur klonal, R. Chailakhyan dkk. (2001) menemukan bahwa sel-sel individual yang membentuk koloni fibroblas, serta keturunannya, memiliki potensi proliferatif yang sangat besar. Pada bagian ke-10, jumlah fibroblas pada beberapa galur adalah 1,2-7,2 x 109 ^sel. Selama perkembangannya, mereka melakukan penggandaan sel hingga 31-34. Dalam kasus ini, transplantasi heterotopik galur yang berasal dari sumsum tulang yang dibentuk oleh prekursor stroma dari beberapa lusin klon menghasilkan transfer lingkungan mikro sumsum tulang dan pembentukan organ hematopoietik baru di zona transplantasi. Penulis mengajukan pertanyaan apakah klon individual mampu mentransfer lingkungan mikro sumsum tulang dari sel-sel stroma atau apakah kerja sama beberapa prekursor stroma klonogenik yang berbeda diperlukan untuk ini? Dan jika klon-klon individual mampu mentransfer lingkungan mikro, apakah itu akan lengkap untuk ketiga tunas hematopoietik, atau apakah klon-klon yang berbeda menyediakan pembentukan lingkungan mikro untuk tunas-tunas hematopoietik yang berbeda? Untuk mengatasi masalah-masalah ini, sebuah teknologi dikembangkan untuk membudidayakan sel-sel progenitor stroma pada gel kolagen, yang memungkinkan koloni-koloni fibroblas yang tumbuh untuk dikeluarkan dari permukaan untuk transplantasi heterotopik berikutnya. Klon-klon individual fibroblas stroma yang tumbuh dari sel-sel sumsum tulang tikus CBA dan marmut dipotong bersama-sama dengan sebuah fragmen lapisan gel dan ditransplantasikan secara heterotopik - di bawah kapsul ginjal tikus singeneik atau ke dalam otot perut marmut autologus. Ketika ditransplantasikan ke dalam otot, koloni-koloni pada gel ditempatkan di selubung tulang.

Para penulis menemukan bahwa 50-90 hari setelah transplantasi koloni fibroblas sumsum tulang, perkembangan tulang atau jaringan tulang dan hematopoietik diamati di zona transplantasi pada 20% kasus. Pada 5% hewan penerima, fokus jaringan tulang yang terbentuk berisi rongga yang diisi dengan sumsum tulang. Di dalam silinder tulang, fokus tersebut memiliki bentuk bulat dan kapsul yang dibangun dari jaringan tulang dengan osteosit dan lapisan osteoblastik yang berkembang dengan baik. Rongga sumsum tulang berisi jaringan retikuler dengan sel myeloid dan eritroid, hubungan proporsional yang tidak berbeda dari yang ada di sumsum tulang normal. Di ginjal, transplantasi adalah organ sumsum tulang khas yang terbentuk selama transplantasi sumsum tulang asli, dengan kapsul tulang menutupi rongga sumsum tulang hanya dari sisi kapsul ginjal. Jaringan hematopoietik termasuk elemen myeloid, eritroid, dan megakariosit. Stroma rongga sumsum tulang memiliki sistem sinus yang berkembang dengan baik dan berisi sel-sel lemak yang khas. Pada saat yang sama, jaringan tulang tanpa tanda-tanda hematopoiesis ditemukan di zona transplantasi beberapa koloni di bawah kapsul ginjal. Studi tentang potensi proliferatif dan diferensiasi klon individu dilanjutkan pada galur sumsum tulang monoklonal kelinci, yang sel-selnya disuspensikan kembali dalam media nutrisi dan dalam spons ivalon terpisah dengan massa 1-2 mg ditransplantasikan di bawah kapsul ginjal donor sumsum tulang kelinci. Sel-sel dari 21 galur monoklonal menjadi sasaran autotransplantasi tersebut. Hasilnya diperhitungkan setelah 2-3 bulan. Para penulis menemukan bahwa dalam 14% kasus, galur monoklonal yang ditransplantasikan membentuk organ sumsum tulang yang terdiri dari jaringan tulang dan rongga sumsum tulang yang diisi dengan sel-sel hematopoietik. Dalam 33% kasus, galur yang ditransplantasikan membentuk tulang kompak dengan berbagai ukuran dengan osteosit yang terkurung dalam rongga dan lapisan osteoblastik yang berkembang. Dalam beberapa kasus, jaringan retikuler tanpa tulang atau elemen hematopoietik berkembang di spons dengan klon yang ditransplantasikan. Kadang-kadang, stroma retikuler dengan jaringan sinusoid yang berkembang baik terbentuk, tetapi tidak diisi dengan sel hematopoietik. Dengan demikian, hasil yang diperoleh mirip dengan data yang diperoleh selama transplantasi klon pada gel kolagen. Namun, jika transplantasi klon yang tumbuh pada substrat mengakibatkan pembentukan jaringan sumsum tulang pada 5% kasus, jaringan tulang pada 15% dan jaringan retikuler pada 80% kasus, maka dengan transplantasi galur monoklonal, pembentukan elemen sumsum tulang diamati pada 14% kasus, jaringan tulang pada 53% dan jaringan retikuler pada 53% kasus. Menurut penulis, ini menunjukkan bahwa kondisi untuk penerapan potensi proliferatif dan diferensiasi fibroblas stroma selama transplantasi pada perancah berpori lebih optimal daripada selama transplantasi mereka dalam selubung tulang dan pada substrat kolagen.Ada kemungkinan bahwa penggunaan metode kultur dan transplantasi balik klon yang lebih maju dapat meningkatkan kondisi untuk realisasi potensi diferensiasi klon dan mengubah rasio ini. Dengan satu atau lain cara, tetapi signifikansi utama dari penelitian yang dilakukan adalah bahwa beberapa klon sel stroma mampu membentuk jaringan tulang dan secara bersamaan menyediakan lingkungan mikro hematopoietik stroma untuk tiga tunas hematopoiesis sumsum tulang sekaligus: eritroid, mieloid, dan megakariosit, menciptakan platform jaringan hematopoietik yang cukup besar dan beberapa massa tulang.

Para penulis kemudian membahas masalah kemampuan sel-sel progenitor stroma klonogenik individual untuk menjalani jenis-jenis diferensiasi sel ini dalam sistem ruang difusi tertutup. Selain itu, perlu untuk menentukan apakah klon-klon individual memiliki polipotensi atau apakah manifestasi potensi diferensiasi memerlukan interaksi kooperatif beberapa klon dengan sifat sitodiferensiasi tetap, yang rasio-rasio yang berbeda menentukan pembentukan tulang, retikuler, atau jaringan tulang rawan yang lebih disukai. Dengan menggabungkan dua pendekatan metodologis - memperoleh galur monoklonal sel-sel progenitor stroma sumsum tulang dan mentransplantasikannya ke dalam ruang difusi - R. Chailakhyan dan rekan penulis (2001) memperoleh hasil yang memungkinkan mereka untuk lebih memahami organisasi struktural stroma sumsum tulang. Transplantasi galur monoklonal sel-sel progenitor stroma ke dalam ruang tipe-O menghasilkan pembentukan jaringan tulang dan tulang rawan, yang menunjukkan kemampuan keturunan dari satu sel pembentuk koloni stroma untuk secara bersamaan membentuk jaringan tulang dan tulang rawan. Asumsi bahwa jaringan tulang dan tulang rawan berasal dari sel induk stroma yang sama telah berulang kali dikemukakan. Akan tetapi, hipotesis ini tidak memiliki konfirmasi eksperimental yang benar. Pembentukan tulang dan tulang rawan di ruang difusi merupakan bukti yang diperlukan tentang keberadaan sel induk stroma sumsum tulang yang sama untuk kedua jenis jaringan ini.

Kemudian 29 galur klonal dari pasase kedua-ketiga yang diperoleh dari kultur primer sumsum tulang kelinci ditempatkan dalam ruang difusi dan ditanamkan secara intraperitoneal ke hewan homolog. Penelitian menunjukkan bahwa 45% galur monoklonal sumsum tulang memiliki potensi osteogenik. Sembilan ruang berisi jaringan retikuler secara eksklusif, tetapi jaringan tersebut hadir bersama dengan tulang dan jaringan tulang rawan di 13 ruang lainnya, yang merupakan 76% dari semua galur. Di ruang tipe O, tempat diferensiasi jaringan tulang dan tulang rawan dimungkinkan, 16 galur dipelajari. Di empat ruang (25%) terbentuk jaringan tulang dan tulang rawan. Perlu dicatat sekali lagi bahwa dalam penelitian R. Chailakhyan et al. (2001), sel progenitor individu mengalami 31 hingga 34 penggandaan dalam satu galur sel, dan keturunannya terdiri dari 0,9-2,0 x 109 ^sel. Jumlah mitosis yang dijalani sel progenitor galur poliklonal secara virtual identik dengan galur monoklonal. Laju perkembangan galur poliklonal, terutama pada fase pertama pembentukannya, bergantung pada jumlah koloni yang digunakan untuk menginisiasi galur tersebut. Galur diploid fibroblas embrionik manusia (WI-38), ketika direkloning pada tingkat penggandaan ke-12-15, juga membentuk koloni yang berbeda dalam diameter dan isi sel. Koloni besar yang mengandung lebih dari 103 sel hanya merupakan 5-10%. Dengan peningkatan jumlah pembelahan, persentase koloni besar menurun. Galur monoklonal dan poliklonal fibroblas stroma sumsum tulang mempertahankan satu set kromosom diploid setelah 20 atau lebih penggandaan, dan kecenderungan perkembangannya sebanding dengan dinamika perkembangan galur diploid fibroblas embrionik. Analisis potensi diferensiasi sel progenitor stroma sumsum tulang belakang individu, yang dilakukan dengan mentransplantasikan galur monoklonal ke dalam ruang difusi, menunjukkan bahwa setengahnya bersifat osteogenik. Koloni besar mencakup 10% dari jumlah totalnya. Akibatnya, jumlah sel pembentuk koloni osteogenik setara dengan sekitar 5% dari total populasinya. Total massa sel progenitor osteogenik yang diidentifikasi oleh penulis mencakup sel yang mampu membentuk tulang dan jaringan tulang rawan secara bersamaan. Selain itu, untuk pertama kalinya ditetapkan bahwa kedua jenis jaringan ini pada organisme dewasa memiliki sel progenitor yang sama: 25% klon yang diuji dibuat oleh sel-sel tersebut, dan jumlahnya di antara total populasi sel progenitor setidaknya 2,5%.

Dengan demikian, transplantasi heterotopik klon individu fibroblas sumsum tulang telah mengungkapkan aspek baru dari organisasi struktural populasi sel progenitor mesenkimal. Sel progenitor stroma telah ditemukan yang mampu mentransfer lingkungan mikro spesifik untuk semua tunas hematopoietik sekaligus, yang jumlahnya di antara klon besar yang dipelajari dalam model yang berbeda berkisar antara 5 hingga 15% (0,5-1,5% dari jumlah total sel progenitor yang terdeteksi). Bersamaan dengan klon yang mentransfer lingkungan mikro sumsum tulang lengkap, ada sel progenitor yang ditentukan hanya untuk osteogenesis, yang, ketika ditransfer dalam sistem terbuka, membentuk jaringan tulang yang tidak mendukung perkembangan hematopoiesis. Jumlah mereka dari jumlah total sel progenitor adalah 1,5-3%. Beberapa dari sel-sel ini mampu membentuk jaringan tulang dengan periode pemeliharaan diri yang terbatas. Akibatnya, populasi sel progenitor stroma bersifat heterogen dalam potensi diferensiasinya. Di antara mereka, ada kategori sel yang mengklaim sebagai sel induk stroma, yang mampu berdiferensiasi dalam ketiga arah yang menjadi ciri khas jaringan stroma sumsum tulang, membentuk tulang, tulang rawan, dan jaringan retikuler. Data yang disajikan memungkinkan kita untuk berharap bahwa, dengan menggunakan berbagai penanda sel, akan memungkinkan untuk menentukan kontribusi setiap jenis sel stroma terhadap pengaturan lingkungan mikro tertentu dan dukungan hematopoiesis dalam kultur Dexter.

Fitur sel punca mesenkimal

Dalam beberapa tahun terakhir, telah ditetapkan bahwa dalam kultur sumsum tulang stasioner, sel progenitor mesenkimal multipotensi diwakili oleh populasi terbatas sel agranular kecil (sel RS-1) yang dicirikan oleh kapasitas pembentukan koloni yang rendah dan tidak adanya ekspresi antigen Ki-67 yang spesifik untuk sel yang berproliferasi. Parameter antigenik sel RS-1 yang tidak aktif berbeda dari spektrum antigen sel progenitor stroma berkomitmen yang berproliferasi cepat. Telah ditetapkan bahwa tingkat proliferasi yang tinggi dari sel progenitor berkomitmen diamati hanya dengan adanya sel RS-1. Pada gilirannya, sel RS-1 meningkatkan laju pertumbuhannya di bawah pengaruh faktor yang disekresikan oleh derivatif paling matang dari sel progenitor mesenkimal multipotensi. Tampaknya sel RS-1 adalah subkelas MSC yang tidak berkomitmen yang mampu didaur ulang. In vitro, sel progenitor stroma sumsum tulang yang resistan terhadap 5-fluorourasil dicirikan oleh kandungan RNA yang rendah dan ekspresi tinggi gen ornithine decarboxylase, suatu penanda sel yang tidak berproliferasi.

Proliferasi intensif sel-sel progenitor stroma dimulai setelah fiksasi pada substrat. Dalam hal ini, profil penanda sel-sel yang berdiferensiasi buruk diekspresikan: SH2 (reseptor TGF-(3)), SH3 (domain protein pensinyalan), kolagen tipe I dan III, fibronektin, reseptor adhesi VCAM-1 (CD106) dan ICAM (CD54), kadherin-11, CD44, CD71 (reseptor transferin), CD90, CD120a dan CD124, tetapi tanpa ekspresi penanda karakteristik sel induk hematopoietik (CD34, CD14, CD45). Pertumbuhan klonal memungkinkan untuk melewati sel-sel induk mesenkimal berulang kali dengan pembentukan banyak sel pluripoten progenitor stroma yang homogen secara genetik dalam kultur. Setelah 2-3 kali melewati, jumlahnya mencapai 50-300 juta. Dalam kultur dengan kepadatan yang cukup, setelah proliferasi berhenti, sel-sel progenitor stroma, tidak seperti fibroblas jaringan hematopoietik, berdiferensiasi menjadi adiposit, miosit, tulang rawan, dan sel-sel tulang. Kombinasi tiga sinyal diferensiasi regulatori, termasuk 1-metil-isobutilxantin (penginduksi pembentukan cAMP intraseluler), deksametason (penghambat fosfolipase A dan C), dan indometasin (penghambat siklooksigenase, yang juga mengurangi aktivitas tromboksan sintase), mengubah hingga 95% sel mesenkim progenitor menjadi adiposit. Pembentukan adiposit dari elemen stroma yang belum matang dikonfirmasi oleh ekspresi gen lipoprotein lipase, deteksi histokimia apolipoprotein, dan reseptor peroksisom. Sel-sel klon yang sama di bawah pengaruh TGF-b dalam media bebas serum menciptakan populasi kondrosit yang homogen. Kultur sel berlapis-lapis dari jaringan tulang rawan ini ditandai dengan matriks antarsel yang berkembang yang terdiri dari proteoglikan dan kolagen tipe II. Dalam media nutrisi dengan 10% Efek kompleks sinyal diferensiasi yang terdiri dari b-gliserofosfat (donor fosfat anorganik), asam askorbat dan deksametason dalam kultur sel progenitor stroma yang sama mengarah pada pembentukan agregat seluler. Dalam sel-sel tersebut, peningkatan progresif dalam aktivitas alkali fosfatase dan kadar osteopontin diamati, yang menunjukkan pembentukan jaringan tulang, mineralisasi sel-sel yang dikonfirmasi oleh peningkatan progresif dalam kandungan kalsium intraseluler.

Menurut beberapa data, kemampuan sel punca mesenkimal untuk melakukan pembelahan dan reproduksi tanpa batas dari berbagai jenis sel garis diferensiasi mesenkimal dipadukan dengan tingkat plastisitas yang tinggi. Ketika dimasukkan ke dalam ventrikel atau materi putih otak, sel punca mesenkimal bermigrasi ke parenkim jaringan saraf dan berdiferensiasi menjadi turunan dari garis sel glia atau neuronal. Selain itu, ada informasi tentang transdiferensiasi MSC menjadi sel punca hematopoietik baik secara in vitro maupun in vivo. Analisis yang lebih mendalam dalam beberapa penelitian telah menentukan plastisitas MSC yang sangat tinggi, yang terwujud dalam kemampuannya untuk berdiferensiasi menjadi astrosit, oligodendrosit, neuron, kardiomiosit, sel otot polos, dan sel otot rangka. Sejumlah penelitian tentang potensi transdiferensiasi MSC secara in vitro dan in vivo telah menetapkan bahwa sel-sel progenitor mesenkimal multipotensi asal sumsum tulang berdiferensiasi secara terminal menjadi garis sel yang membentuk tulang, tulang rawan, otot, saraf dan jaringan adiposa, serta tendon dan stroma yang mendukung hematopoiesis.

Akan tetapi, penelitian lain gagal mengungkap tanda-tanda pembatasan pluripotensi genom sel punca mesenkimal dan populasi progenitor sel stroma, meskipun lebih dari 200 klon MSC yang diisolasi dari satu kultur primer dipelajari untuk menguji kemungkinan pluripotensi sel stroma. Sebagian besar klon in vitro mempertahankan kemampuan untuk berdiferensiasi dalam arah osteogenik, kondrogenik, dan adipogenik. Ketika mengecualikan kemungkinan migrasi sel penerima dengan mentransplantasikan sel punca mesenkimal di bawah kapsul ginjal atau di ruang difusi, ternyata sel progenitor stroma in situ mempertahankan fenotipe heterogen, yang menunjukkan tidak adanya faktor restriksi di zona transplantasi atau tidak adanya pluripotensi MSC seperti itu. Pada saat yang sama, keberadaan jenis sel punca pluripoten somatik yang langka, yang merupakan prekursor umum dari semua sel punca dewasa, diperbolehkan.

Multipotensi, tetapi bukan pluripotensi, dari sel punca mesenkimal sejati, yang merupakan proporsi yang sangat kecil dari sel sumsum tulang dan mampu berkembang biak dalam kondisi tertentu selama kultivasi in vitro tanpa berdiferensiasi, dibuktikan dengan komitmen yang diinduksi terhadap sel tulang, tulang rawan, jaringan adiposa, jaringan otot, serta tenosit dan elemen stroma yang mendukung hematopoiesis. Sebagai aturan, paparan yang lama terhadap media kultur dengan serum anak sapi janin memicu pelepasan MSC ke dalam sel progenitor stroma yang berkomitmen, yang keturunannya mengalami diferensiasi terminal spontan. In vitro, adalah mungkin untuk mencapai pembentukan osteoblas yang ditargetkan dengan menambahkan deksametason, ß-gliserofosfat, dan asam askorbat ke dalam media pengkondisian, sementara kombinasi sinyal diferensiasi deksametason dan insulin menginduksi pembentukan adiposit.

Telah ditetapkan bahwa sebelum memasuki tahap diferensiasi terminal, MSC sumsum tulang awalnya berdiferensiasi menjadi sel punca mesenkimal mirip fibroblas dalam kondisi kultur tertentu. Turunan sel-sel ini secara in vivo berpartisipasi dalam pembentukan tulang, tulang rawan, tendon, jaringan adiposa dan otot, serta stroma yang mendukung hematopoiesis. Banyak penulis memahami istilah "sel progenitor mesenkimal multipotensi" berarti MSC itu sendiri dan sel progenitor stroma berkomitmen dari sumsum tulang dan jaringan mesenkimal. Analisis klonal sel progenitor mesenkimal multipotensi asal sumsum tulang menunjukkan bahwa sedikit lebih dari sepertiga dari semua klon berdiferensiasi menjadi osteo-, kondro- dan adiposit, sedangkan sel-sel klon yang tersisa hanya memiliki potensi osteogenik dan hanya membentuk kondro- dan osteosit. Klon sel progenitor mesenkimal multipotensi seperti BMC-9, dalam kondisi lingkungan mikro yang sesuai, berdiferensiasi menjadi sel dengan fenotipe dan karakteristik fungsional tidak hanya osteoblas, kondrosit, dan adiposit, tetapi juga sel stroma yang mendukung hematopoiesis. Klon sel RCJ3.1 yang diisolasi dari sumsum tulang janin tikus berdiferensiasi menjadi sel mesenkimal dengan berbagai fenotipe. Di bawah aksi gabungan asam askorbat, b-gliserofosfat, dan deksametason, elemen seluler klon ini pertama-tama membentuk miosit multinuklear, dan kemudian, secara berurutan, adiposit, kondrosit, dan pulau-pulau jaringan tulang yang termineralisasi. Populasi sel granular dari periosteum janin tikus sesuai dengan sel progenitor mesenkimal multipotensi yang tidak terikat, karena dicirikan oleh laju proliferasi yang rendah, tidak mengekspresikan penanda diferensiasi, dan dalam kondisi kultur berdiferensiasi untuk membentuk kondro-, osteo-, dan adiposit, serta sel otot polos.

Dengan demikian, harus diakui bahwa pertanyaan mengenai pluripotensi atau multipotensi genom sel punca mesenkimal masih terbuka, yang, karenanya, juga memengaruhi gagasan mengenai potensi diferensiasi sel progenitor stroma, yang juga belum ditetapkan secara pasti.

Karakteristik sel punca mesenkimal yang terbukti secara eksperimental dan penting adalah kemampuannya untuk meninggalkan ceruk jaringan dan bersirkulasi dalam aliran darah umum. Untuk mengaktifkan program diferensiasi genetik, sel punca yang bersirkulasi tersebut harus memasuki lingkungan mikro yang sesuai. Telah ditunjukkan bahwa dengan pengenalan MSC secara sistematis ke dalam aliran darah hewan penerima, sel-sel yang belum matang ditanamkan ke dalam berbagai organ dan jaringan, kemudian berdiferensiasi menjadi sel darah, miosit, adiposit, kondrosit, dan fibroblas. Akibatnya, di zona jaringan lokal, interaksi pengaturan sinyal terjadi antara sel progenitor stroma yang tidak terikat dan terikat, serta antara sel-sel tersebut dan sel-sel matang di sekitarnya. Diasumsikan bahwa diferensiasi diinduksi oleh faktor pengatur parakrin yang berasal dari mesenkimal dan non-mesenkimal (faktor pertumbuhan, eikosanoid, molekul matriks ekstraseluler), yang menyediakan hubungan spasial dan temporal dalam lingkungan mikro sel progenitor mesenkimal multipotensi. Oleh karena itu, kerusakan lokal pada jaringan mesenkimal akan mengarah pada pembentukan zona lingkungan mikro sel progenitor mesenkimal multipotensi yang secara kualitatif berbeda dari kompleks sinyal regulasi jaringan utuh, di mana proses regenerasi fisiologis dan bukan reparatif terjadi. Perbedaan ini sangat penting dalam hal spesialisasi fenotipe seluler dalam lingkungan mikro normal dan yang disebabkan kerusakan.

Menurut konsepnya, di sinilah mekanisme perbedaan mendasar antara dua proses yang diketahui - regenerasi fisiologis dan proliferasi inflamasi - tertanam. Yang pertama diakhiri dengan pemulihan komposisi seluler khusus jaringan dan fungsinya, sedangkan hasil dari penerapan proses proliferasi adalah pembentukan elemen jaringan ikat dewasa dan hilangnya fungsi zona jaringan yang rusak. Dengan demikian, untuk mengembangkan program optimal untuk penggunaan sel progenitor mesenkimal multipotensi dalam pengobatan regeneratif-plastik, diperlukan studi menyeluruh tentang fitur dampak faktor lingkungan mikro pada diferensiasi MSC.

Ketergantungan struktur kompartemen sel punca pada regulator para- dan autokrin seluler, yang ekspresinya dimodulasi oleh sinyal eksternal, tidak diragukan lagi. Di antara fungsi faktor pengatur, yang terpenting adalah kontrol pembelahan asimetris MSC dan ekspresi gen yang menentukan tahap komitmen dan jumlah pembelahan sel. Sinyal eksternal, yang menjadi dasar perkembangan MSC selanjutnya, disediakan oleh lingkungan mikronya. Dalam keadaan belum matang, MSC berkembang biak dalam waktu lama, sambil mempertahankan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi garis adiposit, miofibroblast, stroma jaringan hematogen, tulang rawan, dan sel tulang. Telah ditetapkan bahwa populasi terbatas elemen seluler stroma CD34-negatif yang beredar dalam darah kembali dari aliran darah umum ke stroma sumsum tulang, tempat ia diubah menjadi garis sel punca hematopoietik CD34-positif. Pengamatan ini menunjukkan bahwa resirkulasi sel-sel mesenkim progenitor dalam aliran darah menjaga keseimbangan jaringan sel-sel induk stroma di berbagai organ dengan memobilisasi kumpulan umum elemen stroma yang belum matang dari sumsum tulang. Diferensiasi MSC menjadi sel-sel dengan berbagai fenotipe mesenkim dan partisipasinya dalam regenerasi atau perbaikan tulang, tulang rawan, jaringan adiposa, dan tendon secara in vivo telah dibuktikan menggunakan model transfer adoptif pada hewan percobaan. Menurut penulis lain, migrasi MSC yang jauh di sepanjang dasar pembuluh darah dikombinasikan dengan pergerakan jarak pendek atau lokal sel-sel progenitor mesenkim multipotensi di dalam jaringan selama perbaikan tulang rawan, regenerasi otot, dan proses pemulihan lainnya.

Cadangan sel induk lokal dari basis jaringan stroma berperan sebagai sumber sel dalam proses regenerasi jaringan fisiologis dan diisi ulang oleh transportasi MSC jarak jauh saat sumber daya sel induk stroma dikonsumsi. Namun, dalam kondisi perlunya mobilisasi darurat potensi seluler reparatif, misalnya, dalam kasus politrauma, seluruh eselon MSC mengambil bagian dalam proses regenerasi reparatif, dan sel progenitor mesenkimal sumsum tulang direkrut ke perifer melalui aliran darah umum.

Transplantasi sel punca mesenkimal

Paralel tertentu dapat ditelusuri antara proses regenerasi jaringan fisiologis dan pembentukannya selama perkembangan intrauterin. Dalam embriogenesis manusia dan mamalia, pembentukan berbagai jenis sel khusus terjadi dari kumpulan lapisan germinal ekto-, meso-, dan endodermal, tetapi dengan partisipasi wajib dari mesenkim. Jaringan seluler longgar dari jaringan mesenkim embrionik melakukan banyak fungsi pengaturan, metabolisme, kerangka kerja, dan morfogenetik. Peletakan organ sementara terjadi hanya setelah kondensasi mesenkim karena pertumbuhan klonogenik sel progenitor, yang menghasilkan sinyal morfogenetik primer organogenesis. Turunan stroma dari mesenkim embrionik membuat kerangka seluler organ sementara dan membentuk dasar untuk pasokan energi-plastik masa depan mereka karena pertumbuhan pembuluh darah dan limfatik primer. Dengan kata lain, elemen stroma dari unit mikrosirkulasi organ janin muncul sebelum pembentukan unit struktural dan fungsionalnya. Selain itu, migrasi aktif sel-sel mesenkim selama organogenesis memberikan orientasi spasial pada organ-organ yang sedang berkembang dengan menandai batas-batas volumenya melalui pembatasan tipe-tipe Hox homeotik. Kerangka stroma juga berfungsi sebagai dasar untuk perakitan unit-unit struktural dan fungsional organ-organ parenkim, yang sering kali mencakup sel-sel yang secara morfogenetik dan fungsional sama sekali berbeda. Akibatnya, selama embriogenesis, fungsi-fungsi mesenkim bersifat primer dan diwujudkan melalui pembangkitan sinyal-sinyal regulatori yang mengaktifkan proliferasi regional dan diferensiasi sel-sel epitel progenitor. Sel-sel mesenkim embrionik menghasilkan faktor-faktor pertumbuhan seperti HGF-b, HGF-b, CSF, yang sel-sel progenitor parenkimnya memiliki reseptor yang sesuai. Dalam jaringan matang yang berdiferensiasi dari organisme dewasa, jaringan sel-sel stroma juga menghasilkan sinyal-sinyal untuk mempertahankan viabilitas dan proliferasi sel-sel progenitor yang bukan berasal dari mesenkim. Namun, spektrum sinyal pengatur stroma dalam ontogenesis pascanatal berbeda (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, dll.) dan ditujukan untuk memastikan regenerasi fisiologis atau perbaikan zona jaringan yang rusak. Selain itu, karakteristik spektral faktor pengatur stroma di setiap jenis jaringan dan bahkan dalam satu organ berbeda. Secara khusus, hematopoiesis dan limfopoiesis dengan proliferasi dan diferensiasi sel hematopoietik dan imunokompeten hanya terjadi pada organ tertentu, di dalam batas-batas tempat lingkungan mikro stroma beroperasi, menyediakan kondisi untuk pematangan sel hematopoietik dan limfoid. Kemampuan sel hematopoietik dan limfoid untuk mengisi kembali organ tertentu, berkembang biak dan matang dalam relung mikrostrukturnya bergantung pada faktor pengatur lingkungan mikro.

Di antara komponen matriks ekstraseluler yang diproduksi oleh sel progenitor mesenkimal multipotensi, perlu diperhatikan fibronektin, laminin, kolagen, dan proteoglikan, serta CD44 (reseptor hialuronan dan osteopontin), yang berperan besar dalam mengatur interaksi antarsel dan membentuk matriks ekstraseluler di sumsum tulang dan jaringan tulang. Telah terbukti bahwa sel progenitor mesenkimal multipotensi sumsum tulang menciptakan lingkungan mikro stroma yang menyediakan sinyal induktif dan regulasi tidak hanya untuk MSC, tetapi juga untuk progenitor hematopoietik dan sel punca non-mesenkimal lainnya di sumsum tulang. Diketahui bahwa partisipasi MSC dalam hematopoiesis ditentukan oleh kemampuannya untuk berdiferensiasi menjadi sel stroma yang mendukung hematopoiesis, dan sinyal instruktif ini diterima oleh MSC secara langsung dari sel punca hematopoietik. Inilah sebabnya dalam kultur, jaringan sel progenitor stroma berfungsi sebagai basis pemasok bagi perkembangan semua klon sel hematopoietik.

Pada organisme dewasa, intensitas hemo- dan limfopoiesis berada dalam keadaan keseimbangan dinamis dengan "pengeluaran" sel darah dewasa dan sel sistem imun di pinggiran. Karena sel stroma sumsum tulang dan organ limfoid sangat jarang diperbarui, restrukturisasi struktur stroma yang signifikan di dalamnya tidak terjadi. Sistem dapat dikeluarkan dari keseimbangan dinamis oleh kerusakan mekanis pada salah satu organ hemo- atau limfopoiesis, yang mengarah pada perubahan berurutan yang seragam yang tidak hanya menyangkut dan tidak begitu banyak elemen hematopoietik atau limfoid tetapi juga struktur stroma organ yang rusak. Dalam proses regenerasi reparatif, basis stroma terbentuk terlebih dahulu, yang kemudian diisi kembali oleh sel hematopoietik atau imunokompeten. Fakta yang telah lama diketahui ini menjadikan regenerasi pascatrauma sebagai model yang nyaman untuk mempelajari lingkungan mikro stroma organ hematopoietik. Secara khusus, pengosongan mekanis rongga sumsum tulang tubular digunakan untuk mempelajari regenerasi reparatif sumsum tulang - kuretase, yang memungkinkan pembuangan jaringan hematopoietik dari keadaan keseimbangan dinamis secara cepat dan efektif. Ketika mempelajari proses regenerasi reparatif komponen hematopoietik dan stroma sumsum tulang setelah pengosongan mekanis rongga sumsum tibia marmut, ditemukan bahwa tidak ada korelasi langsung antara indeks regenerasi sel hematopoietik dan stroma (jumlah sel hematopoietik, konsentrasi dan jumlah sel progenitor stroma). Selain itu, ternyata peningkatan populasi sel progenitor stroma terjadi pada waktu yang lebih awal setelah kuretase, dan fibroblas stroma sendiri menjadi fosfatase-positif, yang merupakan ciri khas jaringan osteogenik. Telah pula ditetapkan bahwa kuretase 3-5 tulang tubular menyebabkan pertumbuhan populasi sel ini dalam sumsum tulang dari tulang yang tidak dioperasi dan bahkan dalam limpa, yang pada marmut merupakan organ limfopoietik eksklusif.

Gambaran morfologi proses reparatif dalam sumsum tulang tibiae marmut yang dikuret secara umum sesuai dengan data yang diuraikan dalam literatur yang diperoleh dalam percobaan pada hewan spesies lain, dan dinamika perubahan yang terjadi setelah pembuangan jaringan hematopoietik adalah sama untuk semua spesies hewan dan perbedaannya hanya menyangkut parameter waktu. Secara morfologi, urutan fase pemulihan hematopoiesis dalam rongga sumsum tulang yang dikosongkan terdiri dari proses-proses berurutan dari organisasi bekuan darah, pembentukan jaringan tulang fibrosa kasar, resorpsinya, perkembangan sinusoid dan pembentukan stroma retikuler, yang kemudian diisi kembali oleh elemen-elemen hematopoietik. Dalam hal ini, jumlah sel hematopoietik progenitor dalam proses regenerasi jaringan sumsum tulang meningkat seiring dengan peningkatan kandungan sel induk hematopoietik.

Yu. Gerasimov dan rekan penulis (2001) membandingkan perubahan jumlah sel hematopoietik dan jumlah sel progenitor stroma dalam fase individu dari proses regenerasi. Ternyata perubahan kuantitatif pada sel sumsum tulang dalam tulang yang dikuret sesuai dengan dinamika karakteristik morfologi regenerasi. Para penulis mengaitkan penurunan kandungan seluler dalam regenerasi selama tiga hari pertama dengan kematian sel hematopoietik karena efek yang tidak menguntungkan dari lingkungan mikro yang diciptakan oleh jaringan retikuler yang berkembang biak di sumsum tulang yang diawetkan di wilayah epifisis, serta dengan pembentukan fokus jaringan osteoid di yang terakhir dan kerusakan vaskular selama kuretase. Pada hari ke 7-12, peningkatan tingkat sel berinti bertepatan dengan munculnya fokus individu hematopoiesis myeloid di zona proliferasi elemen stroma. Pada hari ke-20, area signifikan sumsum tulang yang diregenerasi dan sinus yang berkembang dengan baik muncul, yang disertai dengan peningkatan signifikan dalam jumlah total sel. Namun, jumlah elemen hematopoietik selama periode ini adalah 68% dari tingkat kontrol. Hal ini konsisten dengan data yang dipublikasikan sebelumnya bahwa jumlah sel hematopoietik setelah kuretase mencapai norma hanya pada hari ke-35-40 setelah operasi.

Pada periode pasca-trauma awal, sumber utama untuk pemulihan hematopoiesis adalah elemen seluler lokal yang diawetkan selama kuretase. Pada tahap selanjutnya, sumber utama regenerasi jaringan hematopoietik sumsum tulang adalah sel punca yang mengisi kembali zona stroma bebas. Sedangkan untuk kategori individu sel stroma (endotel, retikuler dan osteogenik), sumber yang memastikan pembentukannya selama reorganisasi rongga sumsum tulang masih belum jelas. Hasil penelitian oleh Yu. V. Gerasimov dan rekan penulis (2001) menunjukkan bahwa dalam sumsum tulang yang diawetkan setelah kuretase, konsentrasi sel yang membentuk koloni fibroblas secara signifikan lebih tinggi daripada di sumsum tulang normal. Para penulis percaya bahwa kuretase menghasilkan pencucian selektif sel hematopoietik yang lebih intensif dibandingkan dengan sel stroma pembentuk koloni, yang berpartisipasi dalam pembentukan stroma dan lebih kuat terkait dengan substansi utamanya daripada sel hematopoietik.

Dinamika perubahan jumlah sel pembentuk koloni fibroblas berkorelasi dengan intensitas proses osteogenesis, resorpsi trabekula tulang berikutnya, dan pembentukan stroma retikuler, yang dihuni oleh sel-sel hematopoietik. Sebagian besar sel progenitor stroma dalam istilah regenerasi yang ditentukan membentuk jaringan tulang fibrosa kasar dan stroma retikuler. Dalam kasus fraktur femur dalam kondisi osteosintesis yang berkepanjangan, pada hari ke-5 di zona regenerasi, konsentrasi dan jumlah sel pembentuk koloni fibroblas meningkat, dan selama periode pembentukan tulang intensif, jumlahnya meningkat 6 kali lipat. Diketahui bahwa sel sumsum tulang yang membentuk koloni fibroblas memiliki sifat osteogenik. Jumlah sel progenitor stroma meningkat sebelum penyelesaian wilayah sumsum tulang yang dikuret oleh sel-sel hematopoietik. Ini sesuai dengan data bahwa sel-sel stroma menyediakan pembentukan lingkungan mikro hematopoietik. Rupanya, penciptaan lingkungan mikro hematopoietik sesuai dengan tingkat regenerasi jaringan stroma tertentu, dan jumlah sel hematopoietik meningkat seiring perluasan platform stroma yang cocok untuk hematopoiesis.

Yang paling menarik adalah data penulis bahwa segera setelah kuretase jumlah sel progenitor stroma di bagian kerangka yang jauh meningkat. Dimulai dari jam keenam dan hingga hari kedua puluh inklusif, peningkatan lebih dari dua kali lipat dalam konsentrasi dan jumlah sel yang membentuk koloni fibroblas diamati di tibia kontralateral. Mekanisme fenomena ini mungkin terkait dengan fakta bahwa cedera sumsum tulang yang masif menyebabkan pembentukan sejumlah besar bekuan darah dengan penghancuran simultan sejumlah besar trombosit dan pelepasan faktor pertumbuhan yang berasal dari trombosit (PDGF) ke dalam darah, yang diketahui menyebabkan proliferasi sel yang membentuk koloni fibroblas yang terletak di dalam tubuh di luar kumpulan proliferatif. Dalam percobaan pada kelinci, pemberian MSC lokal mendorong pemulihan jaringan tulang rawan sendi lutut yang rusak akibat pembedahan, yang dapat dikaitkan dengan pembentukan kondrosit yang berasal dari MSC yang disuntikkan. Namun, regenerasi reparatif cacat tulang pada tikus laboratorium ditingkatkan secara signifikan dengan menggunakan sel punca mesenkimal yang tertutup dalam kerangka keramik. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa jika bukan RBOC, maka beberapa faktor lain yang berasal dari sel stroma yang rusak memberikan efek stimulasi jarak jauh pada proliferasi sel progenitor mesenkimal di zona sumsum tulang yang utuh dan merangsang migrasi mereka ke area kerusakan sumsum tulang. Pada gilirannya, hal ini bertentangan dengan data literatur dari tahun-tahun sebelumnya yang menunjukkan bahwa sel stroma yang bertanggung jawab atas lingkungan mikro, tidak seperti sel hematopoietik, tidak mampu bermigrasi dan berasal dari sumber lokal.

Namun demikian, hasil penelitian oleh Yu. Gerasimov dan rekan penulis (2001) menunjukkan bahwa trauma mekanis tidak hanya menyebabkan restrukturisasi tajam jaringan stroma pada tulang yang dikuret, tetapi juga perubahan signifikan pada stroma pada tulang utuh yang jauh, yaitu, ada respons sistemik jaringan stroma terhadap trauma lokal. Selain itu, ketika politrauma ditimbulkan - kuretase ganda - reaksi ini ditingkatkan dan diamati tidak hanya pada tulang yang dioperasi dan bagian kerangka yang jauh, tetapi juga pada organ limfoid, khususnya di limpa. Mekanisme respons sistemik jaringan stroma sumsum tulang dan limpa terhadap trauma lokal dan politrauma masih belum diketahui. Diasumsikan bahwa proses ini terkait dengan aksi faktor humoral yang disekresikan oleh stroma mesenkim rongga sumsum tulang. Kemungkinan produksi oleh sel-sel stroma sumsum tulang dan limpa dari faktor humoral non-spesifik organ yang bertanggung jawab atas proliferasi sel-sel yang membentuk koloni fibroblas dibuktikan oleh data tentang aktivitas perangsang koloni mereka dalam kultur monolapis sumsum tulang.

Dalam hal ini, perlu dicatat bahwa dengan pemberian sistemik sel progenitor mesenkimal multipotensi, turunannya tidak hanya mengisi kembali sumsum tulang, tetapi juga jaringan lain, yang digunakan, khususnya, untuk terapi gen. Telah ditunjukkan bahwa dengan pemberian MSC dalam jumlah besar secara intravena dengan genom tipe liar kepada tikus dengan mutasi pada gen kolagen I, sel donor menggantikan hingga 30% sel dalam jaringan tulang dan tulang rawan penerima, dan sel punca mesenkimal tikus yang ditransfeksi yang mengeluarkan IL-3 manusia secara efektif mendukung hematopoiesis selama 9 bulan dalam kasus pemberian simultan dengan sel punca hematopoietik manusia kepada tikus yang mengalami defisiensi imun.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Modifikasi genetik sel punca mesenkimal

Di antara keberhasilan modifikasi genetik eksperimental MSC, perlu dicatat transfeksi gen faktor IX ke dalam MSC manusia dengan transfer sel transfektan berikutnya ke tikus imunodefisiensi, yang menyebabkan munculnya faktor B antihemofilik dalam darah selama 8 minggu setelah transplantasi. Dalam percobaan ini, modifikasi pascatranslasi faktor IX oleh y-glutamil karboksilase dilakukan pada sel yang ditransfeksi. Transduksi MSC dengan vektor retrovirus yang mengkode faktor IX manusia kurang berhasil - pemberian sel-sel ini berikutnya kepada anjing dengan hemofilia B memberikan kadar faktor IX terapeutik, mempertahankan intensitas normal hemostasis koagulasi, hanya selama 12 hari.

Transplantasi sel punca mesenkimal ke dalam parenkim otak hewan telah menunjukkan bahwa sel donor yang belum matang diubah menjadi populasi neuron dan glia. Pencangkokan turunan neuron dari jaringan mesenkimal donor yang sehat secara teoritis memungkinkan untuk memperbaiki kelainan genetik metabolisme otak pada pasien dengan penyakit Gaucher dan gangguan lain pada metabolisme lipid, gangliosida, atau karbohidrat.

Pencarian eksperimental untuk kondisi transdiferensiasi sel induk stroma sumsum tulang menjadi sel progenitor jaringan saraf dan hati sedang berlangsung. Perhatian para peneliti difokuskan pada kombinasi penginduksi diferensiasi dan media terkondisi khusus. Secara khusus, untuk mengisolasi kultur primer sel stroma, sel sumsum tulang yang dicuci dan disuspensikan kembali dalam media kultur DMEM/F12 (1/1) dengan 10% serum janin sapi disemai pada kepadatan 200.000/cm2. Setelah 24 jam, sel yang tidak melekat dihilangkan, dan sel mirip fibroblas yang menempel pada plastik dikultur selama satu minggu. Untuk diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi neuroblas, digunakan media terkondisi yang diperoleh dari kultivasi tiga hari kultur primer fibroblas embrionik tikus, serta media DMEM/F12 (1/1) dengan 2% serum anak sapi janin dan penambahan 20 ng/ml NF atau 10-6 M asam retinoat (neuroinducer yang digunakan untuk diferensiasi saraf sel induk embrionik tikus dan manusia). Diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi sel prekursor hepatosit diinduksi dalam media terkondisi yang dibuat sebagai hasil dari kultivasi tiga hari kultur primer sel hati embrionik tikus dalam media DMEM/F12 (1/1) dengan penambahan 10% serum anak sapi janin.

Di sini perlu dicatat sekali lagi bahwa sel-sel pembentuk koloni stroma sumsum tulang bersifat heteromorfik dan dapat dibagi menjadi dua jenis. Jenis pertama mencakup sel-sel seperti fibroblas yang membentuk filopodia dengan nuklei besar dan satu atau dua nukleolus. Jenis kedua diwakili oleh sel-sel kecil berbentuk gelendong. Ketika membudidayakan sel-sel dari kedua jenis dalam media terkondisikan yang diperoleh pada lapisan pengumpan fibroblas embrionik tikus primer, sel-sel yang mirip dengan neuroblas muncul dalam kultur pada hari ke-3 hingga ke-4. Pada tahap ini, mereka paling sering memiliki bentuk seperti gelendong dengan satu atau dua proses panjang yang berakhir di filopodia. Yang kurang umum adalah sel piramidal atau stellate dengan dendrit pendek. Dendrit dari beberapa neuroblas memiliki perluasan karakteristik (tunas pertumbuhan) dan cabang di bagian distalnya, sementara yang lain memiliki kerucut pertumbuhan yang berbeda dengan filopodia, tempat dendrit tumbuh. Ciri morfologi serupa (tunas dan kerucut pertumbuhan dengan filopodia) yang melekat pada neuroblas yang berdiferensiasi menjadi neuron telah dijelaskan secara rinci dalam studi tentang neurogenesis. Berdasarkan hal ini, beberapa penulis menyimpulkan bahwa sel yang mereka temukan dalam kultur adalah neuroblas. Secara khusus, E. Shchegelskaya dan rekan penulis (2002) setelah mengkultur kultur primer sel stroma selama dua minggu dalam media terkondisi yang diganti setiap hari ke-3 hingga ke-4 menemukan bahwa beberapa sel berkembang biak sambil mempertahankan keadaan tidak berdiferensiasi. Secara lahiriah, sel-sel tersebut menyerupai fibroblas dan terdeteksi dalam kultur bersama dengan neuroblas yang berdiferensiasi. Mayoritas sel (sekitar 80%) berada pada berbagai tahap diferensiasi menjadi sel-sel jaringan saraf, terutama menjadi neuron. Proses dendritik sel-sel ini berhubungan erat satu sama lain, sehingga sel-sel tersebut secara bertahap membentuk bagian-bagian jaringan saraf pada substrat dalam bentuk untaian multiseluler yang panjang. Proses dendritik neuroblas menjadi lebih panjang secara signifikan, beberapa di antaranya melebihi panjang badan neuron itu sendiri sebanyak 8-10 kali. Proporsi sel piramidal dan stellate secara bertahap meningkat. Dendrit sel stellate bercabang. Menurut penulis, diferensiasi sel piramidal dan stellate yang lebih lambat dibandingkan dengan sel berbentuk spindel sesuai dengan urutan tahapan neurogenesis normal pada hewan. Akibatnya, penulis menyimpulkan bahwa sel punca stroma sumsum tulang mengalami neurogenesis yang diinduksi, di mana ketiga jenis neuron utama terbentuk dari neuroblas secara in vitro. Prekursor sel saraf juga terdeteksi selama budidaya sel stroma sumsum tulang selama 3-4 hari dalam media dengan 2% serum janin dan 20 ng/ml LIF. Tetapi dalam kasus ini, sel punca membelah sangat lambat, diferensiasi neuroblas hanya terjadi pada 30% kasus dan mereka tidak membentuk jaringan saraf. Dengan menggunakan asam retinoat sebagai salah satu penginduksi diferensiasi sel saraf, penulis memperoleh hingga 25-30% sel saraf dalam kultur,dengan elemen glia yang dominan - astrosit dan oligodendrosit. Neuron hanya merupakan sepertiga dari semua sel saraf, meskipun mereka diwakili oleh ketiga jenis: sel berbentuk gelendong, piramidal dan sel bintang. Pada hari ke-6 kultur sel stroma dalam media dengan asam retinoat, sel-sel saraf menjadi lebih terdiferensiasi, dan akson ditemukan pada neuron piramidal individu, yang dalam neuroontogenesis normal muncul lebih lambat daripada pembentukan proses dendritik. Menurut penulis, meskipun hasil sel saraf rendah, metode induksi asam retinoat memiliki kelebihan: oligodendrosit dan astrosit melakukan fungsi mielinisasi dan nutrisi selama pertumbuhan dendrit dan akson dan diperlukan untuk pembentukan jaringan saraf normal. Oleh karena itu, untuk perbaikan area yang rusak secara in vivo, lebih baik menggunakan suspensi neuron yang diperkaya dengan sel glia.

Pada rangkaian percobaan kedua, penulis mencoba menginduksi diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi sel hati. Setelah tiga hari membudidayakan sel induk stroma sumsum tulang dalam media terkondisi yang diperoleh dengan menginkubasi hepatosit embrio tikus, ditemukan sel-sel besar dan bulat, sering kali berinti dua, dengan inklusi sitoplasma dengan berbagai ukuran. Sel-sel ini berada pada berbagai tahap diferensiasi dan berbeda dalam ukuran, jumlah inti, dan inklusi dalam sitoplasma. Glikogen terdeteksi di sebagian besar sel ini, yang menjadi dasar penulis mengidentifikasi mereka sebagai sel prekursor hepatosit. Karena tidak ada sel yang mirip dengan neuroblas yang ditemukan dalam kultur, disimpulkan bahwa media terkondisi yang diperoleh sebagai hasil dari membudidayakan hepatosit embrio tidak memiliki faktor diferensiasi sel saraf dan, sebaliknya, mengandung faktor yang menginduksi diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi sel prekursor hepatosit. Sebagai kesimpulan, penulis menyarankan adanya pluripotensi dalam sel stroma sumsum tulang, karena mereka berdiferensiasi secara in vitro menjadi sel jaringan saraf atau hati tergantung pada media terkondisi dan penginduksi spesifik yang digunakan.

Beberapa penelitian memang telah menunjukkan dengan tepat diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi sel kardiomiosit, tulang rawan, tulang, dan jaringan saraf. Ada bukti bahwa di antara sel sumsum tulang terdapat populasi sel punca yang mampu berdiferensiasi menjadi hepatosit. Berdasarkan data ini, hasil percobaan pada tikus di atas masih dapat dianggap sebagai konfirmasi lebih lanjut tentang keberadaan sel punca mesenkimal pluripoten di sumsum tulang yang mampu berdiferensiasi menjadi sel-sel berbagai jaringan organisme dewasa.

Transplantasi sel punca mesenkimal

Dalam transplantasi klinis, sel punca mesenkimal manusia dapat digunakan untuk memastikan perluasan sel punca hematopoietik, serta keturunan awal yang telah berkomitmen. Secara khusus, pengenalan sel punca hematopoietik autolog dan MSC pada pasien kanker setelah kemoterapi dosis tinggi mempercepat pemulihan jumlah neutrofil dan trombosit dalam darah tepi. Transplantasi sel punca mesenkimal alo- dan autolog digunakan untuk mengobati mieloma multipel, anemia aplastik, dan trombositopenia spontan - penyakit yang terkait dengan defek primer pada stroma jaringan hematopoietik. Efisiensi terapi sel dalam patologi onkohematologi dalam banyak kasus lebih tinggi dengan pengenalan sel punca stroma dan hematopoietik secara bersamaan, yang dimanifestasikan oleh pengurangan periode pemulihan hematopoiesis pascaoperasi, penurunan jumlah hasil fatal karena penghancuran non-selektif sel kanker regional dan yang bersirkulasi, di mana sel hematopoietik progenitor pasien sendiri juga mati. Prospek penggunaan MSC dan sel progenitor mesenkimal multipotensi lainnya dalam praktik klinis disebabkan oleh kemudahan relatif untuk memperolehnya dari aspirasi sumsum tulang, perluasan dalam kultur, dan transfeksi gen terapeutik. Pada saat yang sama, implantasi lokal sel progenitor mesenkimal multipotensi dapat digunakan untuk mengkompensasi kerusakan jaringan lokal, dan dalam kasus disfungsi sistemik jaringan asal mesenkimal, masuknya sel-sel tersebut ke dalam aliran darah umum tidak dikecualikan.

Para penulis karya, di mana prospek penggunaan MSC untuk transplantasi lokal, sistemik dan terapi gen dianalisis dari sudut pandang biologi sel stroma, lebih berhati-hati dalam penalaran mereka. Sumsum tulang postnatal secara tradisional dianggap sebagai organ yang terdiri dari dua sistem utama garis sel yang jelas - jaringan hematopoietik itu sendiri dan stroma pendukung yang terkait dengannya. Oleh karena itu, sel punca mesenkimal sumsum tulang awalnya dianggap secara eksklusif sebagai sumber dasar stroma untuk produksi faktor pengatur lingkungan mikro hematopoietik. Kemudian perhatian para peneliti beralih untuk mempelajari peran MSC sebagai sumber punca jaringan rangka. Data terbaru menunjukkan potensi yang tidak terduga untuk diferensiasi sel stroma sumsum tulang dengan pembentukan jaringan saraf atau otot. Dengan kata lain, sel punca mesenkimal menunjukkan plastisitas transgermal - kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi jenis sel yang secara fenotip tidak terkait dengan sel-sel jaringan asli. Pada saat yang sama, beberapa aspek biologi sel stroma sumsum tulang masih belum jelas dan belum terpecahkan baik dalam istilah biologi umum maupun dalam rincian individual, termasuk identifikasi, sifat, asal, perkembangan dan fungsi in vivo sel stroma sumsum tulang, serta potensi diferensiasi yang diizinkan secara ex vivo dan kemungkinan penggunaan terapeutik secara in vivo. Data yang diperoleh tentang potensi MSC, serta hasil penelitian tentang potensi regeneratif sel punca lainnya, sangat bertentangan dengan dogma yang ditetapkan dalam biologi.

Ketika dikultur pada kepadatan rendah, sel induk stroma sumsum tulang membentuk koloni yang berbeda, masing-masing berasal dari satu sel progenitor. Persentase sel progenitor stroma dalam sel sumsum tulang berinti, ditentukan oleh kemampuan pembentukan koloni, sangat bergantung pada kondisi kultur dan spesies MSC. Misalnya, pada hewan pengerat, keberadaan sel pengumpan sumsum tulang yang diradiasi dan serum dalam kultur mutlak diperlukan untuk mendapatkan jumlah maksimum sel progenitor stroma, sedangkan pada manusia, efisiensi pembentukan koloni sel induk mesenkimal tidak bergantung pada pengumpan dan media kultur. Jumlah faktor mitogenik yang diketahui yang merangsang proliferasi sel progenitor stroma terbatas. Ini termasuk PDGF, EGF, FGF, TGF-b, dan IGF1. Dalam kondisi kultur yang optimal, garis MSC poliklonal dapat menahan lebih dari 50 pembelahan sel secara in vitro, sehingga memungkinkan untuk mendapatkan miliaran sel stroma sumsum tulang dari 1 ml aspirasinya.

Akan tetapi, populasi sel stroma sumsum tulang bersifat heterogen, yang dimanifestasikan oleh variabilitas ukuran koloni, laju pembentukan yang berbeda, dan berbagai morfologi sel, yang mencakup rentang dari sel berbentuk gelendong seperti fibroblas hingga sel pipih besar. Selama perkembangan kultur tersebut, heterogenitas fenotipik juga dicatat setelah 20 hari. Beberapa koloni dicirikan oleh ekspresi alkali fosfatase yang tinggi, yang lain tidak mengekspresikannya sama sekali, dan koloni tipe ketiga bersifat fosfatase positif di daerah pusat dan fosfatase negatif di pinggiran. Koloni individu membentuk nodul jaringan tulang (awal mineralisasi matriks ditandai dengan pewarnaan dengan alizarin merah atau untuk kalsium menurut Van Koss). Di koloni lain, terjadi akumulasi lemak, diidentifikasi dengan pewarnaan G dengan minyak merah. Lebih jarang, koloni sel punca mesenkimal membentuk tulang rawan yang diwarnai dengan biru Alcian).

Setelah transplantasi ektopik ke hewan percobaan, galur MGK poliklonal membentuk tulang ektopik dengan stroma retikuler yang dikaitkan dengan mielopoiesis dan adiposit, dan, yang lebih jarang, dengan jaringan tulang rawan. Ketika galur monoklonal sel stroma sumsum tulang ditransplantasikan, kimerisme diamati dalam beberapa kasus, di mana tulang de novo terdiri dari sel-sel jaringan tulang, mengandung stroma dan adiposit asal donor, sementara sel-sel garis keturunan hematopoietik dan sistem vaskular berasal dari penerima.

Hasil penelitian ini mengonfirmasi sifat sel induk dari sel progenitor stroma sumsum tulang yang menjadi asal garis klonal. Hasil tersebut juga menunjukkan bahwa tidak semua sel klonogenik dalam kultur adalah sel induk multipotensi sejati. Beberapa peneliti percaya, dan kami sependapat, bahwa informasi paling andal tentang potensi diferensiasi sesungguhnya dari klon individu hanya dapat diperoleh secara in vivo setelah transplantasi, dan bukan dengan menentukan fenotipe turunannya secara in vitro. Ekspresi penanda fenotipe osteo-, kondro-, atau adipogenesis dalam kultur (ditentukan oleh mRNA atau teknik histokimia) dan bahkan produksi matriks mineralisasi tidak mencerminkan derajat pluripotensi klon individu secara in vivo. Oleh karena itu, identifikasi sel induk dalam kelompok sel stroma hanya mungkin dilakukan secara a posteriori, di bawah kondisi uji transplantasi biologis yang tepat. Secara khusus, kondrogenesis sangat jarang diamati dalam sistem transplantasi terbuka, sedangkan pembentukan tulang rawan jauh dari hal yang tidak umum dalam sistem tertutup seperti ruang difusi atau kultur mikromassa in vitro dari sel stroma, di mana tegangan oksigen rendah lokal tercapai, yang mendorong pembentukan jaringan tulang rawan. Oleh karena itu, bahkan teknik transplantasi, serta kondisi kultur in vitro yang tidak spesifik, secara signifikan memengaruhi rentang diferensiasi MSC.

Transplantasi eksperimental dalam kondisi eksperimental tertentu merupakan standar emas untuk menentukan potensi diferensiasi sel stroma sumsum tulang dan elemen kunci dalam identifikasinya. Secara historis, penelitian tentang transplantasi sel stroma sumsum tulang dikaitkan dengan masalah umum transplantasi sumsum tulang. Telah ditetapkan bahwa lingkungan mikro hematopoietik dibuat dengan mentransplantasikan garis sel stroma sumsum tulang dan memberikan perkembangan ektopik jaringan hematopoietik di zona transplantasi. Asal lingkungan mikro dari donor, dan jaringan hematopoietik dari inang memungkinkan kita untuk mempertimbangkan tulang ektopik sebagai transplantasi sumsum tulang "terbalik" yang sebenarnya. Transplantasi lokal sel stroma sumsum tulang mendorong koreksi defek tulang yang efektif, lebih jelas daripada dengan regenerasi reparatif spontan. Beberapa penelitian praklinis pada model eksperimental telah secara meyakinkan menunjukkan kemungkinan penggunaan transplantasi sel stroma sumsum tulang dalam ortopedi, meskipun pekerjaan dan analisis yang paling cermat diperlukan untuk mengoptimalkan metode ini, bahkan dalam kasus yang paling sederhana. Secara khusus, kondisi optimal untuk perluasan sel stroma osteogenik ex vivo belum ditetapkan, struktur dan komposisi pembawa ideal, serta jumlah sel yang diperlukan untuk regenerasi tulang volumetrik, masih belum berkembang.

Selain penggunaan sel stroma sumsum tulang yang diperluas secara eks vivo untuk regenerasi jaringan asal mesenkimal, plastisitas MSC yang tidak lazim membuka aplikasi potensial untuk regenerasi sel saraf atau pengiriman produk gen ke SSP. Pada prinsipnya, hal ini menyederhanakan terapi sel untuk kerusakan sistem saraf, karena tidak perlu mendapatkan sel punca saraf manusia autologus. Aplikasi potensial sel sumsum tulang untuk pembentukan kardiomiosit dan sel progenitor miogenik asal stroma dan ekstrastromal sejati telah dilaporkan.

Percobaan sedang dilakukan pada transplantasi sistemik sel stroma sumsum tulang untuk pengobatan penyakit rangka umum. Tidak diragukan lagi bahwa sel stroma sumsum tulang adalah populasi yang bertanggung jawab atas kelainan genetik pada penyakit rangka, yang diilustrasikan dengan baik oleh transfer vektor informasi genetik menggunakan sel-sel ini, yang mengarah pada pembentukan jaringan tulang patologis pada hewan percobaan. Namun, kemampuan sel stroma untuk menanamkan, mencangkok, berkembang biak, dan berdiferensiasi dalam tulang rangka setelah dimasukkan ke dalam aliran darah umum belum terbukti.

Hal ini sebagian karena dalam transplantasi sumsum tulang standar stroma tidak ditransplantasikan bersama dengan jaringan hematopoietik, sehingga kriteria ketat untuk menilai keberhasilan pencangkokan sel stroma yang diberikan secara sistemik belum dikembangkan. Perlu diingat bahwa keberadaan gen penanda dalam ekstrak jaringan atau isolasi sel asal donor dalam kultur tidak menunjukkan pencangkokan sel, tetapi hanya kelangsungan hidup mereka. Bahkan penyuntikan intra-arteri sel stroma sumsum tulang ke dalam tungkai tikus dapat menyebabkan pencangkokan hampir nol, meskipun faktanya sel asal donor ditemukan dalam jumlah besar dalam mikrovaskulatur sumsum tulang. Sayangnya, sel-sel tersebut biasanya digambarkan sebagai "dicangkok" hanya berdasarkan deteksi gen penanda untuk sel donor dalam kultur eks vivo. Selain itu, bukti yang meyakinkan tentang integrasi jangka panjang sel asal donor yang berdiferensiasi dan aktif secara fungsional dalam jaringan yang diteliti harus diberikan. Dalam banyak makalah yang diterbitkan yang melaporkan pencangkokan sel stroma sumsum tulang dalam kerangka, tidak adanya data yang jelas seperti ini sangat mencolok. Namun, perlu dicatat bahwa beberapa percobaan hewan yang benar telah menunjukkan pencangkokan sel progenitor stroma yang terbatas tetapi nyata setelah pemberian sistemiknya.

Data ini konsisten dengan hasil penelitian tentang kemungkinan pengiriman sel progenitor miogenik sumsum tulang ke otot melalui sistem vaskular. Namun, tidak boleh dilupakan bahwa jaringan rangka dan otot terbentuk selama perkembangan dan pertumbuhan berdasarkan pergerakan sel ekstravaskular yang menggunakan proses migrasi yang tidak melibatkan sirkulasi darah. Jika jalur sirkulasi independen untuk mengirimkan sel progenitor ke jaringan fase padat memang ada, apakah mungkin untuk mengasumsikan keberadaan sel progenitor mesenkimal yang bersirkulasi secara fisiologis? Apa asal sel-sel ini baik dalam organisme yang sedang berkembang maupun pascanatal, dan bagaimana mereka menembus dinding pembuluh darah? Solusi dari pertanyaan-pertanyaan ini tampaknya mutlak diperlukan dan memerlukan analisis praklinis yang paling cermat. Bahkan setelah jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini ditemukan, aspek kinetik yang bermasalah yang terkait dengan pertumbuhan rangka dan remodeling jaringan ikat akan tetap belum terselesaikan. Pada saat yang sama, pengobatan gangguan osteogenesis dengan mengganti seluruh populasi sel progenitor rangka yang bermutasi dengan elemen stroma yang sehat tampaknya menjadi prospek klinis yang nyata. Dalam kasus ini, zona fraktur lokal atau deformasi akibat osteogenesis patologis, serta perubahan destruktif pada jaringan tulang, dapat diperbaiki menggunakan sel induk stroma yang dikultur secara in vitro. Oleh karena itu, disarankan untuk memfokuskan penelitian di masa mendatang pada masalah transformasi atau koreksi genetik sel progenitor osteogenik bermutasi autolog secara ex vivo.

Rekayasa genetika sel, baik jangka pendek maupun permanen, telah menjadi dasar biologi seluler dan molekuler, sumber dari banyak penemuan ilmiah mengenai peran protein individu dalam metabolisme seluler secara in vitro dan in vivo. Penggunaan teknologi molekuler untuk koreksi patologi herediter dan penyakit manusia sangat menjanjikan bagi pengobatan praktis, karena sifat sel punca stroma sumsum tulang memungkinkan pengembangan skema transplantasi unik untuk koreksi penyakit genetik kerangka. Pada saat yang sama, sel prekursor mesenkimal dapat dengan mudah diperoleh dari penerima di masa mendatang, sel tersebut dapat dimanipulasi secara genetik, dan mampu berkembang biak dalam jumlah besar dalam waktu singkat. Penggunaan sel punca mesenkimal memungkinkan seseorang untuk menghindari keterbatasan dan risiko yang terkait dengan pengiriman materi informasi genetik secara langsung ke pasien melalui konstruksi vektor intravaskular. Strategi serupa berlaku untuk sel punca embrionik, tetapi sel stroma sumsum tulang pascanatal autologus merupakan materi yang lebih disukai, karena pengenalannya menyingkirkan kemungkinan komplikasi imunologis pascatransplantasi. Untuk mencapai efek jangka pendek, misalnya, untuk mempercepat regenerasi tulang, metode yang paling optimal adalah modifikasi genetik sel punca mesenkimal menggunakan elektroporasi, fusi kimia, lipofeksi, plasmid, dan konstruksi adenovirus. Secara khusus, transfeksi virus ke dalam sel stroma sumsum tulang BMP-2 telah terbukti efektif dalam mempercepat regenerasi tulang dalam politrauma eksperimental. Pembuatan konstruksi vektor adenovirus lebih disukai karena tidak adanya toksisitas. Namun, modifikasi genetik sel stroma sumsum tulang dalam kasus ini ditandai dengan stabilitas yang sangat rendah. Selain itu, sel stroma sumsum tulang yang ditransformasi normal memerlukan penggunaan pembawa vektor informasi genetik yang 10 kali lebih menular daripada jenis sel lainnya, yang secara signifikan meningkatkan persentase kematian sel yang ditransfeksi.

Pengobatan penyakit resesif yang disebabkan oleh aktivitas biologis rendah atau nol dari gen tertentu memerlukan modifikasi jangka panjang atau permanen dari sel punca mesenkimal, yang memerlukan penggunaan virus adeno-associated, retrovirus, lentivirus atau chimera adeno-retroviral. Daerah transpor virus ini mampu mentransfer transfeksi DNA besar (hingga 8 kb). Literatur ilmiah telah melaporkan aktivitas biologis eksogen sel stroma sumsum tulang yang ditransfeksi dengan konstruksi retrovirus yang mengkode sintesis molekul pengatur dan penanda - IL-3, CD2, faktor VIII, serta enzim yang terlibat dalam sintesis L-DOPA. Namun, bahkan dalam penelitian ini, penulis menunjukkan sejumlah keterbatasan yang perlu diatasi sebelum penerapan praktis teknologi ini. Masalah pertama adalah mengoptimalkan proses modifikasi MSC ex vivo. Diketahui bahwa proliferasi sel stroma sumsum tulang jangka panjang (3-4 minggu) secara in vitro mengurangi transfeksinya. Pada saat yang sama, untuk mencapai tingkat modifikasi genetik MSC yang tinggi, perlu dilakukan beberapa siklus transfeksi. Masalah kedua terkait dengan durasi ekspresi gen terapeutik, yang belum melebihi empat bulan. Penurunan alami dalam ekspresi gen yang efektif disebabkan oleh inaktivasi promotor dan kematian sel yang dimodifikasi. Dengan prospek umum pemindahan informasi genetik menggunakan sel punca mesenkimal, hasil studi pendahuluan menunjukkan perlunya pengoptimalan lebih lanjut metode transfeksi eks vivo, pemilihan promotor yang memadai yang mengatur aktivitas biologis ke arah yang diinginkan, dan peningkatan kemampuan sel stroma sumsum tulang yang dimodifikasi untuk pemeliharaan diri secara in vivo setelah transplantasi. Perlu dicatat bahwa penggunaan konstruksi retrovirus untuk memodifikasi sel stroma sumsum tulang ke arah yang diinginkan tidak selalu memerlukan pencangkokan wajib. Sel punca mesenkimal yang ditransfeksi dapat melakukan fungsi korektif dengan latar belakang residensi yang stabil dan tanpa penggabungan dan fungsi fisik aktif wajib dalam jaringan ikat. Dalam kasus ini, mereka harus dianggap sebagai pompa mini biologis yang memproduksi suatu faktor in vivo, yang kekurangannya menentukan manifestasi patologi genetik.

Penggunaan sel stroma sumsum tulang yang telah ditransformasi untuk pengobatan patologi genetik dominan, yang ditandai dengan ekspresi gen dengan aktivitas biologis patologis atau abnormal, jauh lebih bermasalah, karena dalam kasus ini perlu untuk memblokir transfer atau implementasi informasi genetik yang terdistorsi. Salah satu metode rekayasa genetika adalah rekombinasi homolog sel induk embrionik untuk menciptakan hewan transgenik. Namun, tingkat rekombinasi homolog yang sangat rendah dikombinasikan dengan masalah identifikasi, pemisahan, dan perluasan rekombinan tersebut tidak mungkin berkontribusi pada penggunaan metode ini secara luas dalam waktu dekat, bahkan jika metode teknologi baru dikembangkan. Pendekatan kedua dalam terapi gen patologi dominan didasarkan pada koreksi otomatis DNA yang rusak, karena mutasi genetik dapat dikoreksi dengan memasukkan DNA eksogen dengan urutan yang diinginkan (oligonukleotida DNA pendek atau oligonukleotida RNA/DNA chimeric), yang mengikat homolog dalam genom yang rusak. Pilihan ketiga melibatkan pemblokiran transmisi informasi patologis, yang dicapai melalui penggunaan oligonukleotida yang dirancang khusus yang mengikat gen tertentu untuk membentuk struktur heliks terner yang menghilangkan kemungkinan transkripsi.

Meskipun koreksi penyakit genetik pada tingkat genom tetap menjadi metode terapi yang paling optimal dan disukai, mRNA juga merupakan vektor yang menjanjikan (bahkan mungkin lebih mudah diakses) untuk memblokir gen dominan negatif. Molekul protein dengan oligonukleotida antisense atau urutan lengkap yang memblokir pengikatan mRNA ke aparatus biosintesis seluler telah lama digunakan untuk menghambat translasi dan/atau meningkatkan degradasi mRNA. Selain itu, RNA untai ganda menginduksi degradasi mRNA yang cepat, yang mekanismenya masih belum jelas. Namun, tidak mungkin bahwa eliminasi mRNA yang ditranskripsi dari alel mutan dengan mutasi pendek atau tunggal akan meningkatkan ekspresi mRNA dari alel normal. Alternatifnya adalah penggunaan ribosintesis martil dan jepit rambut, yang memiliki kemampuan untuk mengikat daerah mRNA yang sangat spesifik dengan induksi pembelahan dan inaktivasi berikutnya selama translasi. Kemungkinan penggunaan metode ini dalam terapi osteogenesis patologis saat ini sedang dipelajari. Terlepas dari apa sebenarnya targetnya - elemen genomik atau sitoplasma, keberhasilan teknologi terapi gen baru akan ditentukan oleh efisiensi penyertaan reagen dalam sel stroma sumsum tulang secara eks vivo, pilihan vektor spesifik yang optimal, dan kemampuan stabil sel punca mesenkimal untuk mengekspresikan faktor-faktor yang diperlukan secara in vivo.

Dengan demikian, penemuan sel punca mesenkimal dengan sifat-sifatnya yang tak terduga menciptakan skema konseptual baru untuk pengembangan lini sel. Namun, penelitian interdisipliner lebih lanjut diperlukan untuk memahami peran biologis sel punca stroma, sifatnya, kemampuannya untuk berdiferensiasi atau berdiferensiasi ulang, signifikansi fisiologisnya selama perkembangan embrio, pertumbuhan pascanatal, pematangan dan penuaan, serta dalam penyakit manusia.