Sel induk mesenkim

Di antara sel induk regional, sel induk mesenchymal (MSCs) menempati tempat khusus, turunannya merupakan matriks stroma dari semua organ dan jaringan tubuh manusia. Prioritas dalam penelitian MSC termasuk dalam perwakilan ilmu biologi Rusia.

Pada pertengahan abad yang lalu, sebuah budaya homogen sel induk sumsum tulang multipotent stromal pertama kali diisolasi di laboratorium A. Friedenshtein. Sel induk Mesenchymal yang menempel pada substrat mempertahankan intensitas proliferasi yang tinggi untuk waktu yang lama, dan pada kultur dengan kepadatan penyemaian rendah, klon sel mirip fibroblas yang tidak memiliki aktivitas fagositik terbentuk pada substrat setelah fiksasi. Pemberhentian proliferasi MSC menghasilkan diferensiasi in vitro spontan ke tulang, lemak, tulang rawan, otot atau sel jaringan ikat. Studi lebih lanjut telah memungkinkan untuk membangun potensi osteogenik dari sel fibroblas seperti stroma sumsum tulang dari berbagai spesies mamalia, dan juga aktivitas pembentukan koloni mereka. Eksperimen in vivo, ditunjukkan bahwa transplantasi heterogen dan ortotopik sel fibroblas pembentuk koloni selesai dengan pembentukan jaringan tulang, kartilaginosa, fibrosa dan adiposa. Karena sel induk sumsum tulang memiliki kapasitas tinggi untuk pembaharuan diri dan berbagai diferensiasi dalam satu sel, mereka telah disebut sel induk progenitor mesenkim multipoten.

Perlu dicatat bahwa selama 45 tahun penelitian mendasar sel induk mesenkim, kondisi sebenarnya telah diciptakan untuk penggunaan turunannya dalam praktik klinis.

Saat ini, tidak ada keraguan bahwa semua jaringan tubuh manusia terbentuk dari sel induk dari sel yang berbeda sebagai hasil proses proliferasi, migrasi, diferensiasi dan pematangan. Namun, baru-baru ini, diyakini bahwa sel induk di tubuh orang dewasa spesifik jaringan, yaitu, yang mampu memproduksi jalur sel khusus hanya dari jaringan tempat mereka berada. Situasi konseptual ini disangkal oleh fakta transformasi sel punca hematopoietik tidak hanya ke unsur seluler dari darah tepi, tetapi juga ke sel-sel hati oval. Selain itu, dan sel induk saraf mampu menimbulkan neuron dan unsur glial, serta garis awal sel progenitor hematopoietik. Pada gilirannya, sel induk mesenchymal, biasanya memproduksi unsur seluler tulang, tulang rawan dan jaringan adiposa, mampu berubah menjadi sel induk saraf. Diasumsikan bahwa dalam proses pertumbuhan, regenerasi jaringan fisiologis dan reparatif, sel progenitor yang tidak terikat dihasilkan dari cadangan batang spesifik jaringan. Misalnya, perbaikan jaringan otot bisa diwujudkan dengan menggunakan sel induk mesenchymal yang bermigrasi dari sumsum tulang ke otot rangka.

Meskipun sel-sel induk lintas pertukaran seperti mengakui tidak semua peneliti kemungkinan penggunaan klinis dari sel-sel batang mesenchymal sebagai sumber untuk transplantasi sel dan vektor sel informasi genetik belum diperdebatkan sebagai sel induk multipoten stroma sumsum tulang, yang dapat relatif mudah untuk mengisolasi dan menyebarkan dalam kultur in vitro. Pada saat yang sama, dalam literatur ilmiah, terus ada laporan potensi pluripotency pada sel punca stroma sumsum tulang. Sebagai bukti, protokol penelitian diberikan dimana, di bawah pengaruh inducer spesifik, transdiferensiasi MSC diubah menjadi sel saraf, kardiomiosit dan hepatosit. Namun, pada beberapa ilmuwan kemungkinan aktivasi ulang dan ekspresi gen embriogenesis awal sangat dipertanyakan. Pada saat yang sama, semua orang mengerti bahwa jika kondisi yang ditemukan untuk memperluas sel induk mesenchymal multipoten untuk pluripotency dari ESCs dalam pengobatan regeneratif dan plastik otomatis diselesaikan banyak masalah etika, moral, agama dan hukum alam. Selain itu, karena dalam kasus ini sel stroma autolog dari pasien menjadi sumber potensial batang regeneratif, masalah penolakan kekebalan terhadap transplantasi sel telah terpecahkan. Betapa sebenarnya prospek ini, masa depan akan segera terlihat.

[1], [2], [3], [4]

Penggunaan sel induk mesenchymal dalam pengobatan

Penggunaan klinik turunan dari sel induk mesenchymal berhubungan terutama dengan pengurangan kerusakan jaringan yang disebabkan oleh lesi termal yang luas dan mendalam dari kulit. Evaluasi eksperimental praklinis kesesuaian sel batang mesenchymal fibroblast-seperti alogenik untuk pengobatan luka bakar dalam dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa sumsum tulang sel batang mesenchymal fibroblast-seperti membentuk monolayer dalam budaya, yang memungkinkan untuk transplantasi mereka untuk mengoptimalkan regenerasi luka bakar yang dalam. Para penulis mencatat bahwa fibroblas embrio memiliki sifat serupa, namun penerapan klinis yang terakhir dibatasi oleh masalah etika dan hukum yang ada. Luka bakar dalam yang dalam dengan kerusakan pada semua lapisan kulit dimodelkan pada tikus Wistar. Luas luka bakar adalah 18-20% dari total permukaan kulit. Pada kelompok eksperimen pertama terdiri dari tikus dengan cedera termal dalam dan transplantasi sel batang mesenchymal fibroblast yang diturunkan alogenik. Kelompok kedua terdiri dari hewan dengan pembakaran termal dan perkebunan trans dari fibroblas embrio embrio. Kelompok ketiga diwakili oleh tikus kontrol dengan luka bakar dalam yang dalam, yang tidak melakukan terapi seluler. Suspensi sel induk mesenchymal fibroblast yang diturunkan dan fibroblast embrio diaplikasikan permukaan luka bakar luka dipipet dalam jumlah 2 × 10 ⁴ sel pada hari ke-2 setelah eksisi pemodelan bakar dan eschar nekrotik terbentuk. Setelah transplantasi sel, permukaan luka bakar ditutupi dengan kain kasa yang dibasahi dengan larutan natrium klorida isotonik dengan gentamisin. Pagar sel sumsum tulang untuk mendapatkan MSC dengan induksi berikutnya dari garis fibroblast dalam sel induk mesenchymal diproduksi pada tikus Wistar dewasa dari femur. Fibroblast embrionik diperoleh dari paru-paru embrio berumur 14-17 hari. Fibroblas embrio dan sel-sel sumsum tulang untuk mendapatkan pra-MSCs dikultur dalam cawan Petri pada 37 ° C dalam iikubatore C02, dalam suasana dengan 5% CO2 95% kelembaban. Fibroblas embrio yang dibudidayakan selama 4-6 hari, sedangkan untuk pembentukan monolayer MSC diperlukan dari 14 hingga 17 hari. Selanjutnya MSC dikelola oleh kriopreservasi sebagai bahan awal untuk sel batang mesenchymal fibroblast yang diturunkan yang disusun oleh pencairan dan kultur MSC selama 4 hari. Jumlah sel induk mesenchymal fibroblast yang dihasilkan lebih dari 3 kali jumlah fibroblas embrio yang timbul selama periode budaya yang sama. Untuk mengidentifikasi sel-sel di transtslantirovannyh luka bakar pada langkah pembiakan genom mereka diberi label menggunakan vektor shuttle virus berdasarkan pada rekombinan adenovirus V jenis pembawa 1AS-2 gen encoding ß-galaktosidase E. Coli. Sel-sel hidup pada berbagai waktu setelah transplantasi terdeteksi imunohistokimia di cryosections dengan menambahkan substrat X-Gal, memberikan warna biru-hijau yang khas. Sebagai hasil dari dinamis visual, planimetris dan kondisi evaluasi histologis luka bakar, ditemukan bahwa bahkan pada hari ke-3 setelah transplantasi sel dalam kelompok yang terisolasi muncul perbedaan yang signifikan selama proses penyembuhan luka. Terutama berbeda, perbedaan ini terjadi pada hari ke 7 setelah transplantasi sel. Hewan-hewan dari kelompok pertama, yang ditransplantasikan sel batang mesenchymal fibroblast-seperti, luka diperoleh warna intens seragam merah, jaringan granulasi tumbuh atas seluruh daerah ke tingkat epidermis, dan membakar permukaan jauh berkurang dalam ukuran. Film kolagen yang terbentuk di permukaan luka agak menipis, tapi terus menutupi seluruh area luka bakar. Hewan-hewan dari kelompok kedua, yang ditransplantasikan fibroblast embrio, jaringan granulasi diangkat ke tingkat epidermis dari tepi luka, tetapi hanya di beberapa tempat, pada saat plazmoreya sama dari luka itu lebih intens dibandingkan dengan kelompok 1, dan Film kolagen awalnya dibentuk hampir menghilang. Pada hewan yang tidak menerima terapi sel, pada hari ke 7, luka bakar adalah jaringan pucat, digali, nekrotik yang ditutupi dengan fibrin. Plasmore dicatat di seluruh permukaan luka bakar. Secara histologis, hewan dari 1 dan 2 kelompok menunjukkan penurunan infiltrasi seluler dan pengembangan pembuluh darah, tanda-tanda proses regenerator baru jadi lebih berat pada tikus di Grup 1. Pada kelompok kontrol terdapat tanda-tanda infiltrasi seluler pada luka, pola histologis pembuluh yang baru terbentuk tidak ada. 15-30 hari ke pengamatan hewan dari luas permukaan kelompok bakar 1 secara signifikan lebih kecil daripada di tikus dari kelompok lain dan permukaan granulasi lebih maju. Dalam hewan dari luas permukaan luka bakar kelompok 2 juga menurun dibandingkan dengan ukuran luka bakar pada kelompok kontrol tikus itu karena untuk epitelisasi marginal. Dalam kontrol kelompok situs permukaan luka bakar tetap granulasi pucat dengan langka, muncul diatasnya spider veins, pulau yang plak fibrinous terus moderat plazmoreya di permukaan luka bakar, sesuatu yang keropeng dilepas sulit tetap. Secara umum, hewan dari kelompok ketiga juga mengurangi ukuran luka, namun ujung luka tetap melemahkan.

Dengan demikian, selama studi perbandingan luka tarif penyembuhan menggunakan mesenchymal stem sel fibroblast yang diturunkan dan fibroblast janin, dan tanpa menggunakan terapi sel ditandai percepatan penyembuhan dari permukaan luka bakar akibat transplantasi sel induk mesenchymal fibroblast yang diturunkan dan fibroblast embrio. Namun, dalam kasus sel induk mesenkim allogeneic fibroblas, tingkat penyembuhan luka lebih tinggi daripada transplantasi fibroblas embrionik. Hal ini diungkapkan dalam mempercepat perubahan fase proses regeneratif - istilah infiltrasi seluler diperpendek, laju pertumbuhan pembuluh darah meningkat, serta pembentukan jaringan granulasi.

Hasil planimetri dinamis menunjukkan bahwa tingkat penyembuhan spontan luka bakar (tanpa penggunaan terapi sel) adalah yang terendah. Pada hari ke 15 dan 30 setelah transplantasi sel induk mesenkim allogeneic fibroblas, tingkat penyembuhan luka lebih tinggi daripada transplantasi fibroblas embrionik. Metode histokimia untuk mendeteksi beta-galaktosidase menunjukkan bahwa setelah transplantasi sel induk mesenkim fibroblas dan fibroblas embrionik, selama keseluruhan periode pengamatan di permukaan dan pada kedalaman luka regenerasi, sel yang dapat ditransplantasikan tetap bertahan. Penulis percaya bahwa tingkat regenerasi luka bakar yang lebih tinggi saat menggunakan sel induk mesenkim fibroblas adalah karena pelepasan faktor stimulasi pertumbuhan biologis aktif oleh sel-sel ini selama pematangan.

Transplantasi autologous atau keratinosit alogenik dan fibroblas alogenik untuk pengobatan luka bakar dan digunakan di klinik. Perlu dicatat bahwa pengobatan bedah anak dengan luka bakar dalam luas adalah tugas yang rumit karena banyaknya tinggi trauma dan bedah intervensi, kehilangan darah yang signifikan, pada reaksi yang berbeda menggunakan media infus. Kesulitan utama dalam pelaksanaan kulit dan bedah plastik dengan luka bakar dalam yang luas, daerah melebihi 40% dari permukaan tubuh, karena tingkat keparahan kondisi dan kurangnya sumber daya kulit donor. Penggunaan mesh graft dengan rasio perforasi besar tidak memecahkan masalah, karena gambar setelah perforasi sel epiteliziruyutsya sangat lambat, dan sering melakukan cangkok kulit yang segaris atau kering. Pelapis seperti luka bakar sebagai ksenokozha, allograft kadaver, lapisan film sintetis tidak selalu cukup efektif, sehingga pengembangan metode baru untuk penutupan lapisan permukaan luka bakar keratinosit berbudaya dan fibroblast. Secara khusus, metode menutup permukaan luka bakar menggunakan allofibroblastov berbudaya menyediakan selama transplantasi diucapkan efek stimulasi pada epidermotsitov proliferasi diawetkan di perbatasan luka di luka bakar, dan dalam keratinosit cangkok jaring jala. Dalam Budkevich L. Et al (2000) menunjukkan hasil dari penerapan metode ini untuk pengobatan luka bakar pada anak-anak. 31 anak dengan trauma termal berusia antara 1 dan 14 tahun di bawah pengamatan. Pada tiga anak total luas luka bakar IIIA-B - derajat IV adalah 40%, 25 - 50-70%, bahkan pada tiga - 71-85% dari permukaan tubuh. Nekrosektomi bedah dini dikombinasikan dengan transplantasi seluruh fibroblas dan autodermoplasti kultur. Dalam pengobatan tahap pertama dilakukan eksisi jaringan nekrotik, yang kedua - pada transplantasi film pembawa allofibroblastov berbudaya, ketiga (48 jam setelah transplantasi dari allofibroblastov berbudaya) - penghapusan matriks dan kulit flaps dengan rasio perforasi autodermoplasty dari 1: 4. Tiga pasien dirawat di klinik dengan penyakit luka bakar parah, pembiakan seluruh fibroblas ditransplantasikan menjadi granulasi luka. Transplantasi allofibroblastov berbudaya dilakukan sekali dalam 18 anak-anak, dua kali - pada 11, 3-2 pasien. Luas permukaan luka yang dilapisi oleh kultur sel adalah 30 sampai 3500 cm2. Khasiat allofibroblastov berbudaya dievaluasi oleh total persentase engraftment dari flaps kulit, waktu penyembuhan luka bakar dan jumlah kematian cedera termal yang parah. Keterlibatan transplantasi selesai pada 86% pasien. Sebagian non-penampilan lipatan kulit dicatat pada 14% kasus. Meski menjalani perawatan intensif, enam (19,3%) anak meninggal. Luas lesi kulit total di dalamnya adalah 40 sampai 70% permukaan tubuh. Transplantasi alo-fibroblas berbudaya tidak terkait dengan hasil fatal dari luka bakar pada pasien manapun.

Menganalisis hasil pengobatan, para penulis mencatat bahwa luka bakar sebelumnya tidak kompatibel dengan kehidupan, untuk mengobati kerusakan termal yang mendalam dari daerah kulit 35-40% dari permukaan tubuh (untuk anak-anak - hingga 3 tahun - adalah luka bakar dalam kritis dengan luas 30%, untuk anak-anak usia - lebih dari 40% permukaan tubuh). Ketika transplantasi bedah berbudaya autodermaplasty necrectomy allofibroblastov dan kulit berikutnya cangkok dengan luka bakar yang besar, perforasi faktor IIIB - tingkat IV tetap kritis, tapi saat ini ada prospek dalam banyak kasus untuk menyelamatkan kehidupan bahkan korban tersebut. Necrectomy bedah dalam hubungannya dengan transplantasi allofibroblastov berbudaya dan autodermaplasty pada anak-anak dengan luka bakar dalam terbukti sangat efektif pada pasien dengan lesi lanjutan dari kulit dengan defisit situs donor. Taktik bedah aktif dan transplantasi allofibroblastov berbudaya mempromosikan stabilisasi cepat dari kondisi umum pasien tersebut, pengurangan jumlah komplikasi infeksi penyakit luka bakar, menciptakan kondisi yang menguntungkan bagi engraftment, mengurangi waktu untuk mengembalikan kulit yang hilang dan durasi perawatan rumah sakit, mengurangi insiden kematian pada pasien dengan luka bakar yang luas. Dengan demikian, transplantasi allofibroblastov berbudaya diikuti flaps kulit autodermaplasty mencapai pemulihan pada anak dengan luka bakar parah, yang sebelumnya dianggap terkutuk.

Telah diketahui secara luas bahwa tujuan utama mengobati penyakit luka bakar adalah memaksimalkan pemulihan kulit yang rusak dan cepat untuk mencegah terjadinya efek toksik, komplikasi infeksi dan dehidrasi pada tubuh. Hasil penerapan sel kultur sangat bergantung pada kesiapan untuk transplantasi luka bakar itu sendiri. Dalam kasus transplantasi keratinosit kultur, 55% (berdasarkan luas) sel yang ditransplantasikan bertahan pada permukaan luka setelah bedah necrectomy, sedangkan pada luka engrafting, frekuensi engraftment dikurangi menjadi 15%. Oleh karena itu, keberhasilan pengobatan luka bakar kulit dalam yang ekstensif memerlukan, di tempat pertama, taktik bedah aktif. Dengan adanya luka bakar derajat IIIB-IV, permukaan luka bakar segera dilepaskan dari jaringan nekrotik untuk mengurangi efek keracunan dan mengurangi jumlah komplikasi penyakit luka bakar. Penggunaan taktik semacam itu adalah kunci untuk mengurangi waktu dari saat mendapatkan luka bakar untuk menutup luka dan lama tinggal pasien dengan luka bakar yang luas di rumah sakit, dan juga mengurangi jumlah kematian secara signifikan.

Laporan pertama tentang keberhasilan penggunaan keratinosit kultur untuk menutupi permukaan luka bakar muncul pada awal tahun delapan puluhan abad yang lalu. Selanjutnya, manipulasi ini dilakukan dengan bantuan lapisan keratinosit kultur, yang paling sering didapat dari autostructures, apalagi dari allokeratinocytes. Namun, teknologi autokeratinoksittoplasty tidak memungkinkan pembentukan bank sel, sementara waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan cangkok yang cukup dari keratinosit cukup besar dan jumlahnya 3-4 minggu. Selama periode ini, risiko pengembangan infeksi dan komplikasi luka bakar lainnya meningkat tajam, yang secara signifikan memperpanjang lama tinggal pasien di rumah sakit. Selain itu, autokeratinosit praktis tidak bertahan selama transplantasi menjadi luka bakar granulasi, dan tingginya biaya media pertumbuhan khusus dan stimulan pertumbuhan keratinosit aktif secara biologis secara signifikan membatasi penerapan klinisnya. Metode bioteknologi lainnya, seperti kolagenoplasti, transplantasi xenoid cryopreserved, dan penggunaan berbagai lapisan biopolimer meningkatkan keefektifan pengobatan permukaan yang luas namun tidak dalam luka bakar. Metode pelapisan permukaan luka dengan fibroblas berbudaya secara fundamental berbeda karena komponen utama kolam sel kultur bukan keratinosit tapi fibroblas.

Sebuah prasyarat untuk pengembangan metode menjabat sebagai bukti bahwa pericytes yang mengelilingi kapal kecil adalah sel genitornymi mesenchymal pro mampu berubah menjadi fibroblas, yang menghasilkan banyak faktor pertumbuhan dan memberikan penyembuhan luka karena efek merangsang kuat pada proliferasi dan adhesi keratinosit. Menggunakan fibroblas berbudaya untuk menutup permukaan luka segera mengidentifikasi sejumlah keuntungan yang signifikan dari metode ini atas penggunaan keratinosit berbudaya. Secara khusus, persiapan fibroblas dalam budaya tidak memerlukan penggunaan khusus promotor media kultur dan pertumbuhan, yang mengurangi biaya transplantasi lebih dari 10 kali biaya memperoleh keratinosit. Fibroblas mudah mengalami passaging, di mana mereka sebagian kehilangan antigen histocompatibility permukaan mereka, yang pada gilirannya memungkinkan untuk digunakan untuk pembuatan transplantasi allogeneic sel dan membuat bank-bank mereka. Memperpendek menerima transplantasi, siap untuk digunakan di klinik, dari 3 minggu (keratinosit) 1-2 hari (untuk fibroblas). Budaya utama fibroblas dapat diperoleh dengan kultur sel dari fragmen kulit diambil di autodermoplasty dan pembibitan sel kepadatan pada subkultur penerimaan fibroblast manusia hanya 20 × 10 ³ per 1 cm ².

Untuk mempelajari efek fibroblas dan protein pengaturnya terhadap proliferasi dan diferensiasi keratinosit, analisis komparatif morfologi dan proliferasi keratinosit pada substrat dari tipe kolagen I dan III serta fibronektin dalam ko-kultur dengan fibroblas manusia telah dilakukan. Keratinosit manusia diisolasi dari fragmen kulit pasien dengan luka bakar yang diambil selama operasi autodermoplasty. Kerapatan keratinosit adalah 50 x 103 sel per cm2. Efikasi klinis transplantasi fibroblas berbudaya dievaluasi pada 517 pasien. Semua pasien dibagi menjadi dua kelompok: orang dewasa pertama yang terkena luka bakar IIA, derajat B - IV; 2 - anak-anak dengan luka bakar dalam derajat IIIB-IV. Evaluasi dinamika organisasi struktural dan fungsional dari fibroblas budaya monolayer, dengan mempertimbangkan peran glikosaminoglikan, fibronektin dan kolagen dalam proses regenerasi memungkinkan penulis menentukan hari ke 3 sebagai periode paling menguntungkan untuk penggunaan kultur fibroblas untuk pembuatan transplantasi. Investigasi pengaruh fibroblas pada proliferasi dan diferensiasi keratinosit menunjukkan bahwa fibroblast in vitro memberikan efek stimulasi, terutama pada adhesi keratinosit, meningkatkan jumlah sel terlampir dan tingkat fiksasi mereka lebih dari 2 kali lipat. Stimulasi proses adhesi disertai dengan peningkatan intensitas sintesis DNA dan tingkat proliferasi keratinosit. Selain itu, ditemukan bahwa keberadaan fibroblas dan matriks ekstraselular yang terbentuk oleh mereka merupakan prasyarat untuk pembentukan aparatus tonofibrillar keratinosit, ikatan interselular dan, pada akhirnya, untuk diferensiasi keratinosit dan pembentukan membran basal. Dalam pengobatan anak-anak dengan luka bakar dalam-dalam, keampuhan klinis transplantasi budaya allofrobloblast yang tinggi telah ditetapkan, terutama pada kelompok pasien dengan lesi kulit yang luas dalam kondisi kekurangan lokasi donor. Studi morfofungsional yang kompleks menunjukkan bahwa fibroblas graft ditandai dengan sintesis DNA aktif, juga kolagen, fibronektin dan glikosaminoglikan yang merupakan bagian dari matriks ekstraselular sel. Para penulis menunjukkan persentase penyerapan fibroblas yang ditransplantasikan tinggi (sampai 96%), penurunan tajam dalam waktu produksinya (dalam waktu 24-48 jam, bukan 2-3 minggu dalam kasus keratinosit), percepatan signifikan dari episiisasi permukaan luka bakar, dan penurunan biaya yang signifikan. Kali) dari teknologi pertumbuhan graft dari fibroblas dibandingkan dengan transplantasi keratinosit. Penerapan transplantasi alo-fibroblas berbudaya memungkinkan untuk menyelamatkan nyawa anak-anak dengan luka bakar kritis - lesi termal lebih dari 50% permukaan tubuh, yang sebelumnya dianggap tidak sesuai dengan kehidupan. Perlu dicatat bahwa selama transplantasi fibroblas embrio alogenik, secara meyakinkan juga terbukti tidak hanya regenerasi dan pemulihan luka yang lebih cepat pada pasien dengan tingkat dan area luka bakar yang berbeda, namun juga penurunan yang signifikan dalam mortalitasnya.

Fibroblas autologous juga digunakan di area operasi plastik kompleks seperti koreksi restoratif cedera pita vokal. Biasanya, untuk tujuan ini, kolagen sapi digunakan, durasinya dibatasi oleh imunogenisitasnya. Menjadi protein asing, kolagen sapi, kolagenase sensitif terhadap penerima dan dapat menyebabkan reaksi kekebalan tubuh, mengurangi risiko yang teknologi persiapan kolagen telah dikembangkan, cross-linked dengan glutaraldehida. Keuntungan mereka terletak pada stabilitas yang lebih besar dan kurang imunogenisitas, yang telah menemukan aplikasi praktis dalam menghilangkan cacat dan atrofi pita suara. Suntikan autologous collagen pertama kali digunakan pada tahun 1995. Teknik ini memastikan pelestarian struktur primer dari serat kolagen autologous, termasuk ikatan silang yang dikatalisis enzimatik intramolekuler. Fakta bahwa serat kolagen alami lebih tahan terhadap degradasi oleh protease dari telopeptides kolagen dilarutkan dimana dipotong. Integritas telopeptides penting bagi struktur kuaterner dari serat kolagen dan silang antara molekul kolagen yang berdekatan. Tidak seperti persiapan kolagen sapi, kolagen autologous tidak menyebabkan respons imun pada penerima, namun tidak cukup efektif sebagai agen pengisian ulang. Koreksi yang terus-menerus dapat dicapai dengan produksi kolagen lokal dengan transplantasi fibroblas autologous. Namun, studi tentang khasiat transplantasi fibroblast autologous di klinik mengungkapkan beberapa kesulitan. Pada periode awal setelah efek klinis transplantasi fibroblast lebih lemah dibandingkan dengan yang setelah pemberian kolagen sapi. Ketika fibroblast autologus berbudaya tidak bisa mengecualikan kemungkinan transformasi fibroblast normal normal, yang disebut myofibroblasts, bertanggung jawab untuk pengembangan fibrosis dan jaringan parut, yang dibuktikan dengan penurunan gel kolagen, karena interaksi spesifik fibroblas dan fibril kolagen. Selain itu, setelah lulus serial in vitro, fibroblas kehilangan kemampuan untuk mensintesis protein matriks ekstraselular.

Meskipun demikian, saat ini teknik pembiakan fibroklon manusia autolog telah dieliminasi secara eksperimental, menghilangkan kelemahan di atas dan tidak mengarah pada transformasi onkogenik fibroblas normal. Fibroblas autologous yang diperoleh dengan metode ini digunakan untuk mengisi cacat jaringan lunak wajah. Dalam sebuah penelitian oleh H. Keller dan rekan penulis (2000), 20 pasien berusia 37 sampai 61 tahun dengan keriput dan bekas luka atrofik mendapat perawatan. Biopsi kulit (4 mm) BTE diangkut ke laboratorium dalam tabung steril yang mengandung 10 ml media kultur (media Elang dengan serum antibiotik, myco-septic, pyruvate dan janin betis). Bahan itu ditempatkan di dalam 3-5 piring budaya dengan diameter 60 mm dan diinkubasi dalam termostat dengan atmosfir yang mengandung 5% CO2. Setelah 1 minggu, sel-sel dikeluarkan dari piring dengan tripsinisasi dan ditempatkan di botol 25 cm2. Sel diberikan pada pasien dengan jumlah 4 x 107. Efek klinis yang signifikan dan terus-menerus diamati pada pasien dengan koreksi lipatan nasolabial, dan juga pada pasien dengan bekas luka pada usia 7 dan 12 bulan setelah transplantasi ketiga dari fibroblas autologous. Menurut flow cytometry, fibroblas berbudaya menghasilkan sejumlah besar kolagen Tipe I. Studi in vitro, kontraktilitas normal fibroblas suntik ditunjukkan. Dua bulan setelah pemberian fibroblas berbudaya subkutan dengan dosis 4 x 107 sel, tikus telanjang tidak terdeteksi. Fibroblas suntik tidak menyebabkan pembentukan parut dan fibrosis difus pada pasien. Menurut penulis, fibroblas autologik implan mampu menghasilkan kolagen secara konstan, yang akan memberi efek peremajaan kosmetik. Dalam kasus ini, karena rentang sel yang terdiferensiasi terbatas, fibroblas yang diambil dari pasien muda lebih efektif daripada yang didapat pada orang lanjut usia. Ke depan, kemungkinan kriopreservasi kultur fibroblast yang diambil dari donor muda diasumsikan kemudian dicangkokkan ke sel induk tua sendiri. Kesimpulannya, tidak sepenuhnya benar kesimpulan bahwa fibroklon autologous di bawah kondisi pelestarian fungsional mereka adalah sarana ideal untuk memperbaiki cacat pada jaringan lunak wajah. Pada saat yang sama, penulis sendiri mencatat bahwa dalam proses penelitian beberapa situasi bermasalah yang terkait dengan penggunaan sistem kolagen fibroblas autologik juga muncul. Efek klinisnya seringkali lebih lemah dibandingkan dengan penggunaan kolagen sapi, yang menyebabkan kekecewaan pada pasien.

Secara umum, data literatur tentang prospek penggunaan klinis sel induk mesenchymal terlihat cukup optimis. Upaya dilakukan untuk menggunakan sel progenitor mesenchymot sumsum tulang autologous multiparten untuk pengobatan lesi sendi degeneratif. Uji klinis pertama dari sel progenitor mesenchyma kultur dalam penanganan patah tulang kompleks dilakukan. Sel mesenkim autologous dan allogenic dari stroma sumsum tulang digunakan untuk membuat jaringan kartilaginosa untuk tujuan transplantasi saat memperbaiki kerusakan tulang rawan artikular karena trauma atau lesi autoimun. Metode penggunaan klinis sel progenitor mesenkim multipoten untuk menghilangkan cacat tulang pada anak dengan bentuk osteogenesis yang tidak lengkap yang disebabkan oleh mutasi gen tipe I kolagen sedang dikembangkan. Setelah mieloablasi, sumsum tulang dari donor sehat yang kompatibel dengan HLA ditransplantasikan ke anak-anak penerima, karena sumsum tulang yang tidak terfragmentasi dapat mengandung sejumlah sel batang mesenchymal yang cukup untuk mengisi defek tulang yang parah. Setelah transplantasi sumsum tulang alogenik, anak-anak tersebut memiliki perubahan histologis yang positif pada tulang trabekular, peningkatan laju pertumbuhan dan penurunan kejadian patah tulang. Dalam beberapa kasus, hasil klinis positif dicapai dengan mentransplantasikan sumsum tulang allogeneic yang terkait erat dan osteoblas. Untuk pengobatan kerapuhan tulang yang disebabkan oleh ketidakseimbangan osteoblas dan osteoklas dalam jaringan tulang, transplantasi MSK juga digunakan. Pemulihan pembentukan tulang dalam kasus ini dicapai karena adanya chimerisasi genangan sel stroma batang dan progenitor pada jaringan tulang pasien.

Metode modifikasi genetik sel induk mesenchymal donor diperbaiki untuk memperbaiki defek genetik jaringan stroma. Diharapkan bahwa dalam sel progenitor mesenchymus yang akan datang di masa depan akan digunakan dalam neurologi untuk mengarahkan chimerisasi sel otak dan menciptakan kumpulan sel sehat yang mampu menghasilkan enzim yang kurang atau faktor yang bertanggung jawab atas manifestasi klinis penyakit ini. Transplantasi sel induk mesenchymal dapat digunakan untuk mengembalikan stroma sumsum tulang pada pasien kanker setelah radio dan kemoterapi, dan dikombinasikan dengan sel sumsum tulang - untuk memulihkan hemopoiesis. Perkembangan terapi substitusi yang ditujukan untuk menghilangkan cacat pada sistem muskuloskeletal dengan bantuan MSC dipromosikan oleh perkembangan teknik di bidang perancangan biomaterial matriks atau biomimetika yang membentuk kerangka yang didominasi oleh keturunan sel induk mesenkim.

Sumber sel induk mesenkim

Sumber utama sel induk mesenchymal adalah sumsum tulang sel hematopoietik stem yang pada mamalia terus berdiferensiasi menjadi sel-sel darah dan sistem kekebalan tubuh, sedangkan sel-sel induk mesenchymal disajikan populasi kecil sel stroma sumsum tulang fibroblast-seperti dan membantu mempertahankan negara dibeda-bedakan dari sel-sel induk hematopoietik. Dalam kondisi tertentu, sel induk mesenchymal berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang rawan dan jaringan tulang. Ketika berlapis pada media kultur di kerapatan tanam sel sumsum tulang mononuklear stroma rendah membentuk koloni sel yang patuh, yang, pada kenyataannya, adalah fibroblast multipoten sel prekursor mesenchymal. Beberapa penulis telah menyarankan bahwa sumsum tulang disetorkan sel batang mesenchymal uncommitted, yang, berkat kemampuan untuk memperbaharui diri dan potensi diferensiasi yang tinggi, menyediakan semua jaringan tubuh pendahulu sel mesenchymal stroma sepanjang hidup organisme mamalia.

Di sumsum tulang, elemen sel stroma membentuk jaringan yang mengisi ruang antara sinusoid dan jaringan tulang. Kandungan MSC yang tidak aktif di sumsum tulang orang dewasa sebanding dengan jumlah sel induk hematopoietik dan tidak melebihi 0,01-0,001%. Sel induk mesenkim yang diisolasi dari sumsum tulang dan tidak mengalami kultivasi tidak memiliki molekul perekat. MSC semacam itu tidak mengekspresikan CD34, ICAM, VCAM, kolagen tipe I dan III, CD44 dan CD29. Oleh karena itu, in vitro, bukan sel induk mesenchymal yang tetap pada substrat kultur, namun turunan progenitor yang lebih maju dari sel induk mesenchymal yang telah membentuk komponen dari sitoskeleton dan alat reseptor molekul adhesi sel. Sel stroma dengan fenotipe CD34 ditemukan bahkan di darah tepi, meskipun jumlahnya jauh lebih sedikit di sumsum tulang daripada sel mononuklear CD34-positif. Sel CD34 diisolasi dari darah dan dipindahkan ke dalam kultur menempel pada substrat dan membentuk koloni sel mirip fibroblas.

Diketahui bahwa pada periode embrio, dasar stroma semua organ dan jaringan mamalia dan manusia muncul dari sel induk mesenkim bersama sebelum dan pada tahap organogenesis. Oleh karena itu, diyakini bahwa dalam tubuh dewasa, sebagian besar sel induk mesenchymal harus berada dalam jaringan ikat dan tulang. Telah ditetapkan bahwa sebagian besar elemen seluler stroma jaringan ikat dan ikat yang longgar diwakili oleh sel progenitor yang berkomitmen, yang bagaimanapun mempertahankan kemampuan untuk berkembang biak dan membentuk klon secara in vitro. Dengan diperkenalkannya sel-sel tersebut ke dalam aliran darah total, lebih dari 20% sel progenitor mesenchymal ditanamkan di antara unsur stroma pada jaringan hematopoietik dan organ parenkim.

Potensi sumber sel induk mesenchymal adalah jaringan adiposa, di antara sel induk dimana prekursor adiposit melakukan derajat yang berbeda telah diidentifikasi. Elemen nenek moyang paling matang dari jaringan adiposa - sel stroma-vaskular, yang sama dengan nenek moyang mesenchymal multipoten dari sumsum tulang dapat berdiferensiasi menjadi adiposit bawah aksi glukokortikoid, faktor pertumbuhan seperti insulin dan insulin. Dalam budaya, sel stromal-vaskular berdiferensiasi menjadi adiposit dan kondrosit, dan pada jaringan adiposa sumsum tulang ada sel yang membentuk adiposit dan osteoblas.

Di otot, sumber batang stroma juga ditemukan. Dalam budaya utama sel yang diisolasi dari otot rangka manusia, sel bentuk stellata dan miotubin multinukleat terdeteksi. Dengan adanya serum kuda, sel-sel stellata berkembang biak secara in vitro tanpa tanda sitodifferentiasi, dan setelah penambahan deksametason ke medium nutrisi, diferensiasinya ditandai dengan munculnya unsur seluler dengan fenotipe sel otot rangka, selaput tulang, kartilaginosa dan adiposa. Akibatnya, sel induk progenitor multiporten multiporten yang berkomitmen dan tidak terikat hadir dalam jaringan otot manusia. Hal ini menunjukkan bahwa populasi sel progenitor yang ditunjukkan pada otot rangka berasal dari prekursor sumsum tulang multiporten multipel yang tidak dikompensasikan dan berbeda dari sel satelit miogenik.

Dalam miokardium tikus yang baru lahir juga menemukan sel stellata perekat, sesuai untuk potensi diferensiasi sel-sel mesenchymal progenitor multipoten, seperti di bawah pengaruh deksametason mereka berdiferensiasi menjadi adiposit, osteoblas, kondrosit, sel-sel otot polos, Myotubes dari otot rangka dan miosit jantung. Telah ditunjukkan bahwa sel otot polos vaskular (pericytes) berasal dari sel progenitor multiporten multiporten perivaskular yang tidak berdiferensiasi. Dalam budaya sel induk mesenchymal perivaskular mengekspresikan-halus aktin otot dan platelet diturunkan faktor pertumbuhan reseptor dan dapat membedakan sel otot setidaknya halus.

Tempat khusus, dalam hal cadangan batang, adalah jaringan tulang rawan, yang potensi reparatifnya sangat rendah diyakini disebabkan oleh defisiensi sel progenitor mesenchymot multipoten atau diferensiasi dan faktor pertumbuhan. Diasumsikan bahwa sel progenitor mesenkim multipoten yang telah disumbangkan sebelumnya ke chondro dan osteogenesis memasuki jaringan kartilaginosa dari sumber jaringan lain.

Asal dan kondisi jaringan untuk komisi sel progenitor mesenchymal di tendon juga tidak mapan. Pengamatan pakar menunjukkan bahwa pada periode pascakelahiran awal sel-sel tendon Achilles kelinci pada kultur primer dan pada bagian pertama mempertahankan ekspresi kolagen dan dekor tipe I, namun dengan kultivasi lebih lanjut mereka kehilangan penanda pembeda dari tenosit.

Perlu dicatat bahwa jawaban untuk pertanyaan apakah memang terlokalisasi di berbagai jaringan sel progenitor mesenchymal multipoten selalu hadir dalam stroma mereka, atau kolam renang jaringan sel induk mesenchymal dikompensasi dengan migrasi sel sumsum batang tulang stroma, masih ditunggu.

Selain sumsum tulang dan zona jaringan mesenkim lainnya dari organisme dewasa, sumber MSC lainnya adalah darah tali pusat. Hal ini menunjukkan bahwa pembuluh darah tali pusat mengandung sel yang memiliki karakteristik morfologi dan antigenik serupa dengan sel progenitor mesenkim multipoten, mampu adhesi dan tidak kalah dengan multipartemen mesenchymal progenitor dari sumsum tulang yang berasal dari potensi diferensiasi. Dalam kultur sel punca mesenchymal dari darah tali pusat, 5 sampai 10% sel progenitor mesenkim multipoten tidak terdeteksi. Ternyata jumlah mereka dalam darah tali pusat berbanding terbalik dengan durasi gestasi, yang secara tidak langsung mengindikasikan migrasi sel progenitor mesenkim multipoten ke berbagai jaringan dalam proses perkembangan janin. Informasi pertama tentang penggunaan sel induk mesenchymal secara klinis berasal dari darah tali pusar, serta berasal dari biomaterial embrionik, didirikan, yang didasarkan pada kemampuan sel induk janin yang diketahui untuk berintegrasi, bertahan dan berfungsi di organ dan jaringan penerima orang dewasa.

Pencarian untuk sumber baru sel punca mesenchymal

Penggunaan sel induk mesenchymal asal embrio, seperti sel janin lainnya, menciptakan sejumlah masalah etika, hukum, hukum dan legislatif. Karena itu, pencarian bahan donor sel ekstraembryonik terus berlanjut. Upaya penerapan klinis fibroblas kulit manusia tidak berhasil, yang telah ditentukan sebelumnya tidak hanya oleh kapasitas finansial teknologi yang tinggi, namun juga oleh diferensiasi fibroblas yang cepat menjadi fibroblas, yang memiliki potensi proliferasi yang jauh lebih sedikit dan menghasilkan sejumlah faktor pertumbuhan yang terbatas. Kemajuan lebih lanjut dalam mempelajari biologi MSK dan prekursor sumsum tulang multiporten multiportial memungkinkan pengembangan strategi untuk penggunaan klinis sel induk mesenkim autologous. Teknologi isolasi mereka, budidaya, reproduksi ex vivo, dan diferensiasi diarahkan diperlukan, pertama-tama, studi tentang spektrum penanda molekuler MSCs. Analisis mereka menunjukkan bahwa pada budaya primer jaringan tulang manusia terdapat beberapa jenis sel progenitor mesenkim multipoten. Fenotip pro-osteoblas ditemukan pada sel yang mengekspresikan penanda sel prekursor stroma STRO-1, namun tidak mengandung penanda osteoblas - alkali fosfatase. Sel semacam itu ditandai oleh kemampuan rendah untuk membentuk matriks tulang termineralisasi, serta tidak adanya ekspresi osteopontin dan reseptor hormon paratiroid. Derivatif sel STRO-1-positif yang tidak mengekspresikan fosfatase alkali diwakili oleh osteoblas setengah matang dan benar-benar berbeda. Telah ditetapkan bahwa unsur seluler dari jalur kloning sel STRO-1-positif tulang trabekular manusia dapat berdiferensiasi menjadi osteosit dan adiposit matang. Arah diferensiasi sel-sel ini bergantung pada efek asam lemak tak jenuh ganda, sitokin proinflamasi - IL-1b dan faktor nekrosis tumor a (TNF-a), serta TGF-b anti-inflamasi dan imunosupresif.

Kemudian ditemukan bahwa multipoten sel prekursor mesenchymal kurang spesifik hanya untuk mereka fenotipe yang melekat, tetapi mengekspresikan penanda kompleks, karakteristik untuk mesenchymal, endotel, sel-sel epitel dan otot dalam ketiadaan ekspresi antigen immunophenotypic sel hematopoietik - CD45, CD34 dan CD14. Selain itu, sel-sel induk mesenchymal dan konstitutif inducibly menghasilkan hematopoietik dan faktor pertumbuhan non-hematopoietik, interleukin, dan kemokin, dan dalam sel-sel prekursor mesenchymal multipoten menyatakan reseptor untuk beberapa faktor pertumbuhan dan sitokin. Di antara sel-sel stroma dasar-dasar tubuh manusia ditemukan dormantnye atau beristirahat sel dengan imunofenotipe, hampir identik dengan profil antigen sel mesenchymal progenitor multipoten 5-fluorouracil baku - mereka dan sel-sel lainnya mengungkapkan CD117, menandai "dewasa" sel induk.

Dengan demikian, sel yang unik untuk sel induk mesenchymal belum terbentuk. Diasumsikan bahwa sel peristirahatan mewakili populasi sel progenitor mesenkim multiporten yang tidak terikat, karena mereka tidak mengekspresikan penanda sel yang dilakukan ke osteo- (Cbfa-1) atau adipogenesis (PPAR-y-2). Pemaparan yang berkepanjangan dari sel pereda yang berkembang biak secara perlahan terhadap serum betis janin menyebabkan pembentukan prekursor terdiferensiasi terdahulu, ditandai dengan pertumbuhan yang cepat. Pertumbuhan klon sel mesenchymal batang tersebut didukung oleh FGF2. Tampaknya genom sel punca stroma cukup erat "tertutup." Ada laporan tentang tidak adanya diferensiasi spontan pada MSK - tanpa kondisi khusus untuk melakukan hal tersebut sehingga tidak diubah bahkan menjadi sel rangkaian mesenchymal.

Untuk mempelajari struktur populasi turunan sel induk mesenchymal, pencarian protein diferensiasi penanda pada sel stroma dan pada kultur primer dilakukan. Dalam koloni uji sel sumsum tulang klonal in vitro menemukan bahwa ketika mengalami budaya utama EGF meningkatkan ukuran rata-rata koloni dan mengurangi ekspresi klonal alkaline phosphatase, sedangkan penambahan hidrokortison mengaktifkan ekspresi alkali fosfatase yang merupakan penanda diferensiasi osteogenik orientasi MSC. Antibodi monoklonal terhadap STRO-1 memungkinkan untuk memisahkan dan mempelajari populasi sel perekat STRO-1-positif dalam sistem heterogen budaya Dexter. Spektrum sitokin yang mengatur tidak hanya proliferasi dan diferensiasi sel hematopoietik dan limfoid tetapi juga terlibat dalam pembentukan, pembentukan dan penyerapan jaringan kerangka melalui mekanisme para, auto dan endokrin telah ditentukan. Pelepasan reseptor sekunder dari utusan sekunder tersebut seperti cAMP, diacylglycerol, inositol trifosfat dan Ca2 +, juga digunakan untuk analisis marker berbagai kategori sel jaringan stroma yang mengekspresikan reseptor yang sesuai. Penggunaan antibodi monoklonal sebagai penanda memungkinkan pembentukan sel retikuler dari stroma organ limfoid ke zona T dan B.

Untuk beberapa saat sengketa ilmiah berlanjut seputar pertanyaan kemungkinan asal MSC dari sel induk hematopoietik. Memang, dengan eksplanasi suspensi sel sumsum tulang ke dalam kultur monolayer, koloni fibrosa yang diskrit tumbuh di dalamnya. Namun, ditunjukkan bahwa kehadiran prekursor koloni fibroblas dan berbagai kuman diferensiasi jaringan hematopoietik di sumsum tulang bukanlah bukti asal usul umum mereka dari sel induk. Dengan bantuan analisis diskriminan sel induk sumsum tulang, ditetapkan bahwa lingkungan mikro dalam transplantasi sumsum tulang heterogen tidak dipindahkan oleh sel hemopoietik, yang membuktikan adanya sumsum tulang populasi MSC yang secara histogenetis tidak bergantung pada sel hematopoietik.

Selain itu, metode kloning selektif memungkinkan untuk mengungkapkan kategori baru sel progenitor stroma pada kultur monolayer sel sumsum tulang, untuk menentukan jumlahnya, untuk mempelajari sifat-sifatnya, potensi proliferatif dan diferensiasi. Ternyata sel-sel mirip fibroblas stroma secara in vitro berkembang biak dan membentuk koloni diploid, yang, dengan kembalinya transplantasi ke dalam tubuh, menyediakan pembentukan organ hematopoietik baru. Hasil penelitian klon individu menunjukkan bahwa di antara sel progenitor stroma ada populasi sel, dalam potensi proliferatif dan diferensiasinya, yang mampu mengklaim peran sel induk jaringan stroma yang secara histogenetis tidak bergantung pada sel hemopoietik batang. Sel-sel populasi ini ditandai oleh pertumbuhan mandiri dan berdiferensiasi menjadi sel progenitor tulang, tulang rawan dan jaringan sumsum tulang retikuler.

Yang sangat menarik adalah hasil studi R. Chailakhian dan rekan penulis (1997-2001) yang membudidayakan sel induk progenitor stroma sumsum tulang kelinci, kelinci percobaan dan tikus pada medium nutrisi yang dilengkapi dengan serum janin bovine. Penulis melakukan eksplanasi dengan kerapatan awal 2-4 x 103 sel sumsum tulang per 1 cm2. Sebagai pengumpan, sel sumsum tulang homolog atau heterolog yang tidak aktif digunakan dalam dosis yang mempertahankan tindakan pengumpan namun benar-benar menghalangi proliferasi mereka. Kolonisasi fibrosa dua koloni primer dua minggu diujicobakan untuk menghasilkan strain monoklonal. Bukti asal klonal koloni diperoleh dengan menggunakan penanda kromosom pada kultur campuran sumsum tulang kelinci percobaan pria dan betina, fotografi kultur live time-lapse, dan juga dalam campuran kultur sumsum tulang sumbu gen CBA dan CBAT6T6. Transplantasi suspensi sel sumsum tulang yang baru saja diisolasi atau fibroblok stroma in vitro di bawah kapsul ginjal dilakukan di perancah berpori isoval atau agar agar-agar, dan juga matriks matriks tulang kelinci yang tidak aktif. Untuk transplantasi klon di penutup tulang, femur betininea dibersihkan dari jaringan lunak dan periosteum, epifisis terpotong dan sumsum tulang dicuci bersih. Tulang dipotong menjadi potongan (3-5 mm), dikeringkan dan diiradiasi dengan dosis 60 Gy. Pada penutup tulang, koloni fibroblas individu ditempatkan dan ditanamkan secara intramuskular. Untuk transplantasi intraperitoneal fibroblas stroma yang tumbuh secara in vitro, ruang difusi tipe A (V = 0,015 cm3, h = 0, l mm) dan O (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) digunakan.

Ketika mempelajari dinamika pertumbuhan strain klonal, R. Chailakhian dan rekan penulis (2001) menetapkan bahwa sel individu yang membentuk koloni fibroblas, dan juga keturunan mereka, memiliki potensi proliferatif yang besar. Pada bagian ke-10, jumlah fibroblas pada beberapa strain adalah 1,2-7,2 x 10 ⁹ sel. Dalam proses pengembangan mereka, mereka melakukan duplikasi hingga 31-34 sel. Dalam kasus ini, transplantasi heterotopik strain sumsum tulang, yang dibentuk oleh prekursor stroma dari beberapa lusin klon, menyebabkan pengalihan lingkungan mikro sumsum tulang dan pembentukan organ hematopoietik baru di zona transplantasi. Penulis mengajukan pertanyaan apakah klon individu mampu memindahkan lingkungan mikro sumsum tulang dari sel stroma atau apakah memerlukan kerja sama beberapa nenek moyang stroma yang berasal dari clonal? Dan jika klon individu mampu memindahkan lingkungan mikro, apakah akan lengkap untuk ketiga kuman tersebut, atau apakah klon yang berbeda menyediakan lingkungan mikro untuk berbagai jenis hematopoietik? Untuk mengatasi masalah ini, sebuah teknologi dikembangkan untuk membiakkan sel progenitor stroma pada gel kolagen, yang memungkinkan untuk dikeluarkan dari koloni fibroblas permukaan yang tumbuh untuk transplantasi heterotopik berikutnya. Klon individu fibroblas stroma yang tumbuh dari sel sumsum tulang tikus CBA dan kelinci percobaan dieksisi bersama dengan fragmen tutup gel dan dipindahkan secara heterotopis di bawah kapsul tikus syngenous ginjal atau ke otot perut kelinci percobaan autologous. Saat transplantasi ke otot, koloni-koloni di gel ditempatkan di tempat kurma.

Para penulis menemukan bahwa dalam 50-90 hari setelah transplantasi koloni fibroblas sumsum tulang, perkembangan jaringan tulang atau tulang dan hemopoietik diamati di zona transplantasi pada 20% kasus. Pada 5% hewan penerima, fokus jaringan tulang yang terbentuk berisi rongga yang penuh dengan sumsum tulang. Di dalam silinder osseus, foci tersebut memiliki bentuk bulat dan kapsul, yang dibangun dari jaringan tulang dengan osteosit dan lapisan osteoblastik yang berkembang dengan baik. Rongga tulang mengandung jaringan retikuler dengan sel myeloid dan eritroid, rasio proporsional yang tidak berbeda dengan sumsum tulang biasa. Di ginjal, cangkok adalah organ sumsum tulang khas yang terbentuk saat transplantasi sumsum tulang asli, dan kapsul tulang menutupi rongga medula hanya dari sisi kapsul ginjal. Jaringan berongga meliputi unsur myeloid, eritroid dan megakaryositik. Stroma rongga meduler memiliki sistem sinus yang berkembang dengan baik dan mengandung sel-sel lemak biasa. Pada saat bersamaan, jaringan tulang tanpa tanda hematopoiesis ditemukan di zona transplantasi beberapa koloni di bawah kapsul ginjal. Studi potensi proliferasi dan diferensiasi klon individual dilanjutkan pada strain sumsum tulang kelinci monoklonal, sel-sel yang disuspensi dalam media kultur dan spons ivalonovoy terpisah dengan berat 1-2 mg terselip di bawah kapsul ginjal dari donor sumsum tulang kelinci. Autotransplantasi tersebut dikenai sel dari 21 strain monoklonal. Hasilnya diperhitungkan dalam 2-3 bulan. Para penulis menemukan bahwa pada 14% kasus, strain monoklonal yang ditransplantasikan membentuk organ sumsum tulang yang terdiri dari jaringan tulang dan rongga sumsum tulang yang penuh dengan sel hematopoietik. Pada 33% kasus, strain yang ditransplantasikan membentuk tulang kompak dengan ukuran berbeda dengan osteosit yang dirusak dalam rongga dan lapisan osteoblastik yang dikembangkan. Dalam beberapa kasus, pada spons dengan klon transplan, jaringan retikuler berkembang tanpa elemen tulang atau hemopoietik. Kadang-kadang, stroma retikuler terbentuk dengan jaringan sinusoid yang berkembang dengan baik, namun tidak dihuni dengan sel hematopoietik. Dengan demikian, hasil yang diperoleh sama dengan yang diperoleh dalam transplantasi kloning pada gel kolagen. Namun, jika transplantasi klon tumbuh pada substrat mengakibatkan pembentukan jaringan sumsum adalah 5% dari tulang - 15% dan kain reticular - pada 80% kasus, transplantasi monoklonal strain pembentukan sel-sel sumsum tulang diamati pada 14% kasus tulang - pada 53% dan retikuler - pada 53% kasus. Menurut penulis, ini menunjukkan bahwa kondisi untuk pelaksanaan proliferasi dan diferensiasi potensi fibroblas stroma ketika ditransplantasikan ke perancah berpori lebih optimal dibandingkan dengan transplantasi mereka dalam tulang dan mencakup substrat kolagen. Ada kemungkinan bahwa penggunaan metode budidaya dan transplantasi klon yang lebih maju dapat memperbaiki kondisi klon untuk mewujudkan potensi pembeda mereka dan mengubah hubungan ini. Salah satu cara atau yang lain, tetapi nilai utama penelitian ini terletak pada kenyataan bahwa beberapa klon sel stroma mampu membentuk jaringan tulang sambil memastikan lingkungan mikro hematopoietik stroma segera selama tiga kecambah darah sumsum tulang: erythroid, myeloid dan megakaryocytic, menciptakan cukup besar pijakan hematopoietik jaringan dan beberapa massa tulang

Selanjutnya, penulis memecahkan masalah kemampuan untuk jenis diferensiasi sel sel progenitor stroma klonal individu dalam kondisi sistem tertutup ruang difusi. Selain itu, perlu untuk mengetahui apakah klon individu memiliki polypotency, atau untuk manifestasi potensial diferensiasi, perlu dilakukan interaksi kooperatif beberapa klon dengan ciri sitoksibensiasi tetap, rasio berbeda yang menentukan pembentukan tulang, jaringan retikuler atau kartilaginosa secara preferensial. Dengan menggabungkan dua pendekatan metodologis - mendapatkan strain monoklonal dari sel induk stroma sumsum tulang dan mentransplantasikannya ke dalam ruang difusi, R. Chaylakhyan dan rekan penulis (2001) memperoleh hasil yang memungkinkan untuk mendekati pemahaman tentang struktur organisasi stroma sumsum. Transplantasi strain monoklonal sel progenitor stroma di kamar tipe-O menghasilkan pembentukan jaringan tulang dan kartilaginosa, yang mengindikasikan kemampuan keturunan sel pembentukan koloni stroma tunggal untuk membentuk jaringan tulang dan kartilaginosa secara bersamaan. Asumsi bahwa jaringan tulang dan kartilagin berasal dari sel progenitor stroma umum telah berulang kali diungkapkan berulang kali. Namun, hipotesis ini tidak memiliki konfirmasi eksperimental yang benar. Pembentukan tulang dan tulang rawan di ruang difusi adalah bukti penting keberadaan sel punca stroma sumsum tulang dari sel prekursor umum untuk kedua jenis jaringan ini.

Kemudian, 29 strain klonal dari bagian kedua dan ketiga yang diperoleh dari budaya primer sumsum kelinci ditempatkan di ruang difusi dan ditanamkan secara intraperitoneal dengan hewan homolog. Penelitian telah menunjukkan bahwa 45% strain monoklonal sumsum tulang memiliki potensi osteogenik. Secara luar biasa, jaringan retikuler berisi 9 bilik, namun bersama dengan jaringan tulang dan kartilaginat terdapat di 13 ruang lagi, yang menyumbang 76% dari semua strain. Di kamar tipe O, di mana diferensiasi dimungkinkan untuk jaringan tulang dan kartilaginosa, 16 strain dipelajari. Dalam empat ruang (25%), jaringan tulang dan kartilaginus terbentuk. Perlu dicatat lagi bahwa dalam studi R. Chailakhian dan rekan penulis (2001), sel progenitor individu mengalami 31 sampai 34 penggandaan dalam strain sel, dan keturunan mereka adalah 0,9-2,0 x 10 ⁹ sel. Jumlah mitosis dimana sel prekursor dari strain poliklonal terpapar hampir sama dengan sel-sel strain monoklonal. Pada saat yang sama, laju perkembangan strain poliklonal, terutama pada fase pertama pembentukannya, sangat bergantung pada jumlah koloni yang digunakan untuk inisiasi strain. Strain strain fibroblas embrionik manusia (WI-38) ketika terbentuk kembali pada tingkat duplikasi 12-15 juga membentuk koloni yang berbeda diameternya dan kandungan sel di dalamnya. Koloni besar yang mengandung lebih dari 103 sel hanya 5-10%. Dengan bertambahnya jumlah divisi, persentase koloni besar menurun. Strain fibroblas sumsum tulang dan poliklonal mempertahankan seperangkat kromosom diploid setelah 20 atau lebih doublings, dan kecenderungan perkembangannya sebanding dengan dinamika perkembangan strain diploid fibroblas embrionik. Analisis potensi diferensiasi sel progenitor stroma sumsum tulang individu, dilakukan dengan mentransplantasi strain monoklonal ke dalam ruang difusi, menunjukkan bahwa setengah dari mereka adalah osteogenik. Koloni besar menyumbang 10% dari jumlah mereka. Akibatnya, jumlah sel pembentukan koloni osteogenik berhubungan dengan sekitar 5% dari total populasi mereka. Pada total massa sel progenitor osteogenik yang diidentifikasi oleh penulis, ada sel yang mampu membentuk jaringan tulang dan kartilaginosa secara bersamaan. Ini pertama kali menetapkan bahwa untuk kedua jenis jaringan di tubuh orang dewasa terdapat sel prekursor umum: 25% klon yang diuji diciptakan oleh sel yang serupa, dan jumlah mereka di antara populasi umum sel progenitor setidaknya 2,5%.

Dengan demikian, transplantasi heterotopik klon individu fibroblas sumsum tulang telah membuka aspek baru dari struktur organisasi populasi sel progenitor mesenchymal. Sel progenitor stroma ditemukan mampu memindahkan lingkungan mikro tertentu segera untuk semua kuman hematopoietik, jumlah di antara klon besar yang dipelajari pada model yang berbeda adalah 5-15% (0,5-1,5% dari jumlah sel prekursor yang terdeteksi). Seiring dengan klon yang membawa lingkungan mikro sumsum tulang penuh, ada sel progenitor yang ditentukan hanya untuk osteogenesis, membentuk jaringan tulang dalam sistem terbuka yang tidak mendukung perkembangan hemopoiesis. Jumlah mereka dari jumlah sel progenitor adalah 1,5-3%. Beberapa sel ini bisa membentuk jaringan tulang dengan periode perawatan diri terbatas. Akibatnya, populasi sel progenitor stroma heterogen dalam potensi diferensiasinya. Diantaranya ada kategori sel yang mengklaim peran sel stroma batang yang dapat berdiferensiasi di ketiga arah yang khas pada jaringan stroma sumsum tulang, sehingga membentuk jaringan tulang, kartilaginosa dan retikuler. Data ini memungkinkan kita untuk berharap bahwa dengan bantuan berbagai spidol sel, memungkinkan untuk menentukan kontribusi masing-masing jenis sel stroma terhadap pengorganisasian lingkungan mikro tertentu dan dukungan hematopoiesis dalam budaya Dexterian.

Fitur sel induk mesenchymal

Dalam beberapa tahun terakhir, telah ditetapkan bahwa pada kultur sumsum tulang stasioner, sel progenitor mesenchymot multipoten diwakili oleh populasi sel agranular kecil (sel RS-1) yang terbatas, yang ditandai dengan pembentukan koloni rendah dan tidak adanya ekspresi antigen Ki-67 yang spesifik untuk sel proliferasi. Parameter antigenik sel RS-1 yang tidak aktif berbeda dari spektrum antigen sel progenitor stroma yang berkembang pesat. Ditemukan bahwa tingkat proliferasi sel progenitor yang tinggi diamati hanya di hadapan sel RS-1. Pada gilirannya, sel RS-1 meningkatkan tingkat pertumbuhan di bawah pengaruh faktor yang disekresikan oleh derivatif paling matang dari sel progenitor mesenchymot multipoten. Tampaknya sel RS-1 adalah subkelas dari MSC yang tidak terikat yang mampu didaur ulang. In vitro, prekursor sumsum tulang stroma 5-fluorouracil-resisten memiliki kandungan RNA rendah dan tingkat ekspresi gen ornithine decarboxylase yang tinggi, penanda sel yang tidak berkembang biak.

Reproduksi intensif sel progenitor stroma dimulai setelah fiksasi pada substrat. Ketika ini profil dinyatakan penanda sel diferensiasi buruk: SH2 (TGF- reseptor (3), SH3 (domain protein signaling), jenis kolagen I dan III, fibronektin, reseptor adhesi VCAM-1 (CD106) dan ICAM (CD54), cadherin-11 , CD44, CD71 (transferin reseptor), CD90, CD120a dan CD124, tapi tanpa ekspresi penanda karakteristik sel induk hematopoietik (CD34, CD14, CD45). Pertumbuhan klonal memungkinkan berulang kali passaged sel induk mesenchymal untuk menghasilkan budaya banyak genetik homogen stroma progenitor pluripotent sel. 2-3 berlalunya jumlah mereka mencapai 50-300.000.000. Dalam budaya kepadatan yang cukup setelah menghentikan proliferasi sel stroma progenitor, tidak seperti fibroblas jaringan hematopoietik berdiferensiasi menjadi adiposit, miosit, sel-sel tulang rawan, dan jaringan tulang. Kombinasi dari tiga diferensiasi sinyal regulasi yang terdiri dari 1-metil-izobutilksantin (inducer pembentukan cAMP intraseluler), deksametason (inhibitor fosfolipase dan C) dan indometasin (inhibitor siklooksigenase, tromboksan menurunkan aktivitas dan) ternyata di adiposit sampai 95% sel mesenkim progenitor. Pembentukan adiposit dari sel stroma dewasa dikonfirmasi ekspresi gen lipoprotein lipase, identifikasi histokimia dari apolipoproteins dan reseptor peroxysomal. Sel dari klon yang sama dipengaruhi oleh TGF-b dalam medium bebas serum menciptakan populasi homogen kondrosit. Kultur sel multi-layer tulang rawan matriks ekstraselular ditandai dikembangkan terdiri dari proteoglikan dan kolagen tipe II. Media nutrisi dengan kompleks 10% serum janin sinyal efek diferensiasi yang terdiri dari b-glycerophosphate (donator fosfat anorganik), asam askorbat dan deksametason, di stroma budaya sel progenitor progenitor yang sama mengarah pada pembentukan agregat sel. Dalam sel-sel tersebut, ada peningkatan progresif dalam aktivitas fosfatase dan osteopontin tingkat basa, menunjukkan pembentukan mineralisasi tulang yang sel dikonfirmasi peningkatan progresif kalsium intraseluler.

Menurut beberapa, kemampuan sel-sel induk mesenchymal untuk membagi tanpa batas waktu dan reproduksi berbagai jenis sel-sel garis mesenchymal dikombinasikan dengan tingkat tinggi plastisitas. Ketika diberikan ke dalam ventrikel, atau materi putih sel induk mesenchymal bermigrasi ke parenkim dari jaringan saraf dan berdiferensiasi menjadi neuron atau glia berasal garis sel. Selain itu, ada bukti transdiferensiasi MSCs menjadi sel hemopoietik batang baik secara in vitro maupun in vivo. Sebuah lebih mendalam analisis dalam beberapa studi ditentukan daktilitas yang sangat tinggi dari MSC, yang diwujudkan dalam kemampuan mereka untuk berdiferensiasi menjadi astrosit, oligodendrocytes, neuron, kardiomiosit, sel-sel otot polos dan sel-sel otot rangka. Dalam sejumlah studi transdifferentsirovochnogo potensi MSC in vitro dan in vivo menemukan bahwa sel-sel mesenchymal prekursor multipoten asal sumsum tulang parah berdiferensiasi menjadi garis sel yang membentuk tulang, tulang rawan, otot, saraf dan jaringan adiposa, serta tendon dan stroma yang mendukung hematopoiesis .

Namun, dalam penelitian lain, tidak ada tanda-tanda pembatasan pluripotency genom sel induk mesenchymal dan tidak bisa terdeteksi populasi sel stroma progenitor, tetapi untuk memeriksa kemungkinan sel pluripoten stroma diselidiki lebih dari 200 klon MSC terisolasi dari budaya primer. Sebagian besar klon in vitro mempertahankan kemampuan untuk berdiferensiasi dalam arah osteogenik, chondrogenik dan adipogenik. Ketika tidak termasuk kemungkinan migrasi sel penerima dengan transplantasi sel induk mesenchymal bawah kapsul ginjal atau di ruang difusi itu muncul bahwa sel-sel stroma progenitor in situ mempertahankan fenotipe heterogen, yang menunjukkan baik adanya transplantasi zona faktor pembatasan atau tidak adanya MSC pluripotent saja. Pada saat yang sama, adanya jenis sel induk pluripoten yang langka, yang merupakan prekursor umum dari semua sel induk dewasa, diperbolehkan.

Pada multi, tetapi tidak benar sel induk mesenchymal pluripoten merupakan sebagian kecil dari sel-sel sumsum tulang dan mampu, dalam keadaan tertentu, ketika berbudaya in vitro untuk berkembang biak tanpa datang ke diferensiasi, terbukti dengan komitmen keturunan mereka diinduksi sel di tulang, tulang rawan, lemak, jaringan otot , serta pada elemen tenosit dan stroma yang mendukung hematopoiesis. Sebagai aturan, pemaparan yang berkepanjangan dalam media kultur dengan serum betis janin memprovokasi keluaran MSC ke dalam sel progenitor stroma yang berkomitmen, keturunannya mengalami diferensiasi akhir spontan. Secara in vitro, adalah mungkin untuk mencapai pembentukan osteoblas terarah dengan menambahkan deksametason, asam-gliserofosfat dan asam askorbat ke media pengkondisian, sedangkan kombinasi sinyal diferensiasi dexamethasone dan insulin menginduksi pembentukan adiposit.

Menetapkan bahwa sebelum memasuki tahap diferensiasi terminal dari sumsum tulang MSC untuk menciptakan kondisi budaya tertentu awalnya berdiferensiasi menjadi sel batang mesenchymal fibroblast-seperti. Turunan dari sel-sel ini in vivo yang terlibat dalam pembentukan tulang, tulang rawan, tendon, lemak dan jaringan otot serta dukungan stroma hematopoiesis. Banyak penulis memahami istilah "multipoten sel progenitor mesenchymal" dengan benar-benar MSC, dan sel-sel stroma progenitor berkomitmen dan jaringan mesenchymal sumsum tulang. Analisis klonal sel progenitor multipoten mesenchymal asal sumsum tulang menunjukkan bahwa sedikit lebih dari sepertiga dari klon dibedakan dalam osteo-, hondro- dan adiposit, sedangkan sel-sel klon lainnya memiliki potensi osteogenik dan formulir hanya hondro- dan osteosit. Ini tiruan dari sel-sel prekursor mesenchymal multipoten sebagai IUD-9, di bawah kondisi yang sesuai mikro dibedakan menjadi sel-sel dengan fenotip dan fungsional karakteristik tidak hanya dari osteoblas, kondrosit dan potsitov adic tetapi sel stroma yang mendukung hematopoiesis. Terisolasi dari sumsum tulang tikus tikus, tiruan sel RCJ3.1 berdiferensiasi menjadi sel mesenkim berbagai fenotipe. Oleh aksi gabungan dari asam askorbat, b-glycerophosphate, dan deksametason dari unsur-unsur seluler dari klon ini pertama kali dibentuk miosit berinti dan kemudian, berturut-turut, adipocytes, kondrosit dan pulau tulang termineralisasi. Populasi sel granular dari periosteum janin tikus sesuai dengan sel-sel progenitor mesenchymal multipoten uncommitted, yang ditandai dengan tingkat rendah proliferasi, tidak mengekspresikan penanda diferensiasi, dan dibedakan dalam kondisi budaya untuk membentuk hondro-, osteo- dan adipocytes dan sel-sel otot polos.

Dengan demikian, harus diakui bahwa pertanyaan tentang pluripoten atau multipotentialitas genom sel induk mesenchymal tetap terbuka, yang karenanya mempengaruhi konsep potensi diferensiasi sel induk progenitor stroma, yang juga tidak ditetapkan secara definitif.

Karakteristik sel induk mesenchymal yang terbukti terbukti secara eksperimental adalah kemampuan mereka untuk meninggalkan ceruk jaringan dan beredar di aliran darah umum. Untuk mengaktifkan program diferensiasi genetik, sel induk yang beredar harus jatuh ke dalam lingkungan mikro yang sesuai. Telah ditunjukkan bahwa ketika MSC secara sistematis diperkenalkan ke dalam aliran darah hewan penerima, sel-sel yang belum matang ditanamkan ke berbagai organ dan jaringan, kemudian berdiferensiasi menjadi sel darah, miosit, adiposit, kondrosit dan fibroblas. Akibatnya, di zona jaringan lokal, ada interaksi sinyal-peraturan antara sel progenitor stroma yang tidak dikreditkan dan dilakukan, dan juga di antara mereka dan sel-sel dewasa di sekitarnya. Hal ini diasumsikan bahwa induksi diferensiasi dilakukan faktor parakrin peraturan mesenchymal asal dan nemezenhimalnogo (faktor pertumbuhan, eikosanoid, molekul matriks ekstraseluler) yang menyediakan hubungan spasial dan temporal dalam lingkungan mikro progenitor mesenchymal multipoten. Oleh karena itu, kerusakan lokal pada jaringan mesenchymal harus mengarah pada pembentukan zona lingkungan mikro dari sel progenitor mesenkim multipoten yang secara kualitatif berbeda dari kompleks sinyal peraturan jaringan utuh dimana regenerasi fisiologis dan tidak reparatif terjadi. Perbedaan ini sangat penting dalam hal spesialisasi fenotipe sel di lingkungan mikro yang normal dan rusak.

Menurut gagasan, di sinilah mekanisme perbedaan mendasar dari dua proses yang diketahui - regenerasi fisiologis dan proliferasi inflamasi - diletakkan. Yang pertama diakhiri dengan restorasi komposisi jaringan seluler khusus dan fungsinya, sedangkan hasil proses proliferasi adalah pembentukan elemen jaringan ikat dewasa dan hilangnya fungsi zona jaringan yang rusak. Dengan demikian, untuk pengembangan program optimal untuk penggunaan sel progenitor mesenkim multipoten dalam pengobatan plastik regeneratif, studi yang cermat mengenai karakteristik pengaruh faktor lingkungan mikro terhadap diferensiasi MSC sangat diperlukan.

Ketergantungan struktur kompartemen sel punca pada regulator seluler dan otokrin seluler, ekspresi yang dimodulasi oleh sinyal eksternal, tidak ada yang meragukan. Diantara fungsi faktor regulasi, yang terpenting adalah kontrol pembagian asimetris MSC dan ekspresi gen yang menentukan tahapan komisioning dan jumlah pembelahan sel. Sinyal eksternal, dimana pengembangan MSC lebih lanjut bergantung, disediakan oleh lingkungan mikro mereka. Pada keadaan belum matang, MSC berkembang biak dalam waktu lama, sambil mempertahankan kemampuan untuk berdiferensiasi di garis adiposit, myofibroblasts, stroma hematogen, tulang rawan dan sel tulang. Telah ditetapkan bahwa populasi sel stromal SB34-negatif yang beredar dalam darah dari aliran darah total kembali ke stroma jaringan sumsum tulang, di mana ia berubah pada garis sel induk hematopoietik CD34-positif. Pengamatan ini menunjukkan bahwa resirkulasi sel mesenkim progenitor di aliran darah memberikan dukungan untuk keseimbangan jaringan sel induk stroma di organ yang berbeda dengan memobilisasi gen umum elemen stroma sumsum tulang yang belum dewasa. Diferensiasi MSC ke dalam sel dengan beberapa fenotipe mesenchymal dan keterlibatannya dalam regenerasi atau perbaikan tulang, kartilaginosa, jaringan adiposa dan tendon in vivo telah ditunjukkan dengan bantuan model transfer adopsi pada hewan percobaan. Menurut penulis lain, migrasi MSK jauh di sepanjang tempat tidur vaskular dikombinasikan dengan perpindahan jarak pendek atau perpindahan lokal dari sel progenitor mesenkim multipoten di dalam jaringan selama perbaikan tulang rawan, regenerasi otot dan proses restoratif lainnya.

Cadangan batang lokal dari basis jaringan stroma memainkan peran sumber sel dalam proses regenerasi jaringan fisiologis dan diisi ulang oleh pengangkutan MSC yang jauh saat sumber daya jaringan stroma-jaringan habis. Namun, dalam konteks kebutuhan akan mobilisasi darurat potensi sel reparatif, misalnya, di polifrauma, keseluruhan eselon MSC berperan dalam proses regenerasi reparatif, dan prekursor sumsum tulang mesenchymal direkrut ke pinggiran melalui aliran darah umum.

Transplantasi sel induk mesenkim

Ada beberapa kesamaan antara proses regenerasi fisiologis jaringan dan pembentukannya selama periode perkembangan intrauterin. Dalam embriogenesis manusia dan mamalia, pembentukan berbagai jenis sel khusus terjadi dari kolam embrio ekto, meso dan endodermal, namun dengan partisipasi mesenkim. Jaringan selular longgar jaringan mesenchymal embrionik melakukan banyak fungsi regulasi, metabolik, skeletal dan morfogenetik. Tabulasi organ sementara dilakukan hanya setelah kondensasi mesenkim karena pertumbuhan klonogenik sel progenitor, yang menghasilkan sinyal morfogenetik utama organogenesis. Turunan stroma mesenkim embrionik menciptakan kerangka seluler organ sementara dan membentuk dasar untuk pasokan energi masa depan mereka dengan menumbuhkan pembuluh darah primer dan pembuluh limfatik. Dengan kata lain, unsur stroma dari unit mikrosirkulasi organ janin muncul sebelum pembentukan unit fungsional struktural mereka. Selain itu, migrasi aktif sel mesenkim selama organogenesis memberikan orientasi spasial organ yang berkembang karena penandaan batas volume mereka dengan membatasi homeopat Noch-Teps. Pada perancah stroma ada juga perakitan unit struktural dan fungsional organ parenkim, yang sering mengandung sel morfogenetis dan fungsional yang sama sekali berbeda. Akibatnya, dalam embriogenesis, fungsi mesenchymal primer dan diwujudkan dengan menghasilkan sinyal regulasi yang mengaktifkan proliferasi regional dan diferensiasi sel epitel progenitorial. Sel mesenkim embrion menghasilkan faktor pertumbuhan seperti LEG, HGF-b, CSF, dimana sel progenitor parenkim memiliki reseptor yang sesuai. Dalam jaringan dewasa matang dari organisme dewasa, jaringan sel stroma juga menghasilkan sinyal untuk mempertahankan viabilitas dan proliferasi sel progenitor asal non-mesenkim. Namun, spektrum sinyal peraturan stroma pada ontogenesis pascakelahiran berbeda (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, dll.) Dan ditujukan untuk memberikan regenerasi fisiologis atau perbaikan zona jaringan yang rusak. Selain itu, karakteristik spektral faktor regulasi stroma pada setiap jenis jaringan dan bahkan di dalam organ yang sama berbeda. Secara khusus, hematopoiesis dan limfopoiesis dengan perbanyakan dan diferensiasi sel hematopoietik dan imunokompeten hanya terjadi pada organ tertentu di dalam batas-batas lingkungan mikro stroma yang beroperasi dengan menyediakan kondisi untuk pematangan sel hematopoietik dan limfoid. Dari faktor regulasi lingkungan mikro, kemampuan sel hematopoietik dan limfoid untuk menampung kembali organ ini, berkembang biak dan matang di relung mikrostrukturnya.

Di antara komponen matriks ekstraselular, yang menghasilkan sel-sel mesenchymal prekursor multipoten, perlu dicatat fibronektin, laminin, kolagen dan proteoglikan, serta CD44 (Hyaluronan dan reseptor osteopontin) menerima bagian utama dalam organisasi interaksi antar dan pembentukan matriks ekstraseluler di sumsum tulang dan tulang . Hal ini membuktikan bahwa sumsum tulang mesenchymal, sel multipoten membuat redshestvenniki stroma mikro, memberikan sinyal induktif dan peraturan tidak hanya MSC, tetapi juga prekursor hematopoietik dan sel-sel sumsum tulang induk nemezenhimalnye. Hal ini diketahui bahwa MSC yang terlibat dalam hematopoiesis diukur oleh kemampuan mereka untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel stroma yang mendukung hematopoiesis, dimana aktif sinyal bimbingan MSK diperoleh langsung dari sel induk hematopoietik. Itulah mengapa budaya jaringan sel stroma progenitor adalah dasar untuk memberi makan semua klon dari sel hematopoietik.

Dalam organisme dewasa, intensitas hemo dan limfopoiesis berada dalam keadaan keseimbangan dinamis dengan "pengeluaran" sel darah matang dan sel sistem kekebalan di pinggiran. Karena sel stroma sumsum tulang dan organ limfoid diperbarui sangat jarang, penataan ulang struktur stroma yang signifikan tidak terjadi di dalamnya. Membawa sistem kesetimbangan dinamis adalah mungkin dengan bantuan kerusakan mekanis untuk setiap organ Hemo atau limfopoiesis, yang mengarah ke jenis yang sama dari perubahan sekuensial yang mempengaruhi tidak hanya dan tidak begitu banyak hematopoietik atau limfoid sel, sebagai struktur stroma organ yang rusak. Dalam proses regenerasi reparatif, basis stroma terbentuk pertama, yang kemudian dihuni kembali oleh sel hematopoietik atau imunokompeten. Fakta ini lama dikenal membuat regenerasi pasca trauma Model nyaman untuk mempelajari lingkungan mikro stroma organ pembentuk darah. Secara khusus, untuk penyelidikan regenerasi reparatif dari sumsum tulang digunakan mekanik mengosongkan rongga medula tulang panjang - kuretase, yang memungkinkan untuk cepat dan efektif membawa jaringan hematopoietik dari keadaan keseimbangan dinamis. Ketika mempelajari proses regenerasi reparatif dari hematopoietik dan sumsum tulang stroma komponen setelah pengosongan mekanik rongga medullar dari kelinci percobaan tibia menemukan bahwa antara indikator regenerasi hematopoietik dan stroma sel (jumlah sel hematopoietik, konsentrasi dan jumlah sel stroma progenitor) tidak ada korelasi langsung. Selain itu, ditemukan bahwa peningkatan populasi sel progenitor stroma terjadi pada tanggal yang lebih awal setelah kuretase, dan diri mereka sendiri fibroblas stroma yang fosfatazopolozhitelnymi, yang merupakan karakteristik dari jaringan osteogenik. Hal ini juga didirikan bahwa kuretase 3-5 tulang panjang mengarah ke pertumbuhan populasi sel di sumsum tulang dan tulang non-dioperasikan bahkan dalam limpa, yang pada marmut hanya tubuh lymphopoietic.

Morfologi proses gambar reparatif di sumsum tulang kyuretirovannyh tibialis guinea babi umumnya sesuai dengan data pustaka yang diperoleh dalam percobaan pada hewan spesies lain, dinamika perubahan yang terjadi setelah penghapusan jaringan hematopoietik adalah sama untuk semua spesies dan perbedaan hanya menyangkut parameter waktu . Secara morfologi prosedur fase untuk memulihkan hematopoiesis di rongga medula dikosongkan dalam proses berturut-turut mengorganisir pembentukan gumpalan darah tulang serat kasar, resorpsi nya, sinusoid dan formasi reticular stroma, yang selanjutnya repopulating elemen hematopoietik. Pada saat bersamaan, jumlah sel hematopoietik progenitor dalam proses regenerasi jaringan sumsum tulang meningkat bersamaan dengan peningkatan kandungan sel hemopoietik batang.

Y. Gerasimov dan rekan penulis (2001) membandingkan perubahan jumlah sel hematopoietik dan jumlah sel progenitor stroma dalam fase individual proses regenerasi. Ternyata perubahan kuantitatif sel sumsum tulang pada tulang yang disembuhkan sesuai dengan dinamika karakteristik morfologi regenerasi. Pengurangan selama tiga hari pertama konten sel dalam penulis meregenerasi atribut hilangnya sel hematopoietik karena efek yang merugikan dari lingkungan mikro, yang menciptakan jaringan reticular tumbuh di sumsum tulang yang tersisa di epiphysis dan yang terakhir untuk membentuk fokus osteoid dan kerusakan pembuluh darah dengan kuretase. Pada hari ke 7-12, peningkatan tingkat sel nukleasi bertepatan dengan munculnya fokus hematopoiesis myeloid terpisah di zona proliferasi unsur stroma. Pada hari ke 20 ada area sumsum tulang regeneratif dan sinus yang berkembang dengan baik, yang disertai dengan peningkatan jumlah sel yang signifikan. Namun, jumlah unsur hematopoietik pada periode ini adalah 68% dari tingkat kontrol. Hal ini sesuai dengan data yang dipublikasikan sebelumnya bahwa jumlah sel hematopoietik setelah kuretase mencapai norma hanya pada hari ke 35-40 setelah operasi.

Pada periode pasca-trauma awal, sumber seluler utama untuk pemulihan hemopoiesis adalah elemen seluler yang tersimpan dalam kuretase. Dalam istilah selanjutnya, sumber utama regenerasi jaringan hematopoietik sumsum tulang adalah sel induk, mengisi kembali zona stroma bebas. Sedangkan untuk kategori sel stromal tertentu (endothelial, reticular dan osteogenic), sumber yang menyediakan formasinya selama rekonstruksi rongga medullary tetap tidak dapat dijelaskan. Hasil dari Yu.V. Gerasimov dan rekan penulis (2001) memberi kesaksian bahwa di sumsum tulang diawetkan setelah kuretase, konsentrasi sel yang membentuk koloni fibroblas secara signifikan lebih tinggi daripada sumsum tulang normal. Penulis percaya bahwa dengan kuretase ada sel leukektif selektif hematopoietik yang lebih intensif dibandingkan dengan sel stroma pembentuk koloni yang berpartisipasi dalam pembentukan stroma dan lebih kuat terkait dengan zat dasarnya daripada sel hematopoietik.

Dinamika jumlah sel yang membentuk koloni fibroblas berkorelasi dengan intensitas proses osteogenesis, resorpsi trabekula tulang selanjutnya dan pembentukan stroma retikuler, yang dihuni oleh sel hematopoietik. Sebagian besar sel progenitor stroma membentuk jaringan tulang berserat kasar dan stroma retikuler pada waktu regenerasi yang ditunjukkan. Pada fraktur femur dalam kondisi osteosintesis berkepanjangan pada hari ke 5 di zona regenerasi, konsentrasi dan jumlah sel yang membentuk koloni fibroblas meningkat, dan pada periode pembentukan tulang intensif jumlah mereka meningkat 6 kali lipat. Diketahui bahwa sel sumsum tulang yang membentuk koloni fibroblas memiliki sifat osteogenik. Jumlah sel progenitor stroma meningkat sebelum kolonisasi area sumsum tulang korteks oleh sel hematopoietik. Ini sesuai kesepakatan dengan bukti bahwa sel stroma menyediakan pembentukan lingkungan mikro hematopoietik. Jelas, penciptaan lingkungan mikro hematopoietik sesuai dengan tingkat regenerasi jaringan stroma tertentu, dan jumlah sel hematopoietik meningkat seiring dengan perluasan jembatan stroma yang sesuai untuk hematopoiesis.

Yang paling menarik adalah data para penulis yang segera setelah kuretase jumlah sel progenitor stroma di bagian-bagian kerangka yang jauh meningkat. Dari jam keenam sampai hari ke-20 inklusif, di tibia kontralateral ada lebih dari dua kali peningkatan konsentrasi dan jumlah sel yang membentuk koloni fibroblas. Mekanisme fenomena ini mungkin berhubungan dengan fakta bahwa cedera sumsum tulang besar yang mengakibatkan pembentukan sejumlah besar pembekuan darah sekaligus menghancurkan sejumlah besar trombosit dan rilis ke dalam darah platelet-derived growth factor (RBSK), yang diketahui menyebabkan proliferasi sel-sel pembentuk koloni fibroblas terletak di tubuh di luar kolam proliferasi. Dalam percobaan pada kelinci, pemerintah lokal MSC mempromosikan pemulihan jaringan tulang rawan lutut yang mengalami operasi pembedahan, yang dapat dikaitkan dengan pembentukan kondrosit yang berasal dari MSC yang disuntikkan. Namun, regenerasi ulang kerusakan tulang pada tikus laboratorium sangat meningkat dengan penggunaan sel induk mesenchymal yang terbungkus dalam kerangka keramik. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa, jika bukan karena PBOK, maka beberapa faktor lain yang berasal dari sel stroma yang rusak memiliki efek stimulasi yang jauh pada proliferasi sel progenitor mesenchymal di daerah sumsum tulang utuh dan merangsang migrasi mereka ke daerah cacat jaringan sumsum tulang. Pada gilirannya, ini bertentangan dengan data literatur tahun-tahun terakhir, yang menunjukkan bahwa sel stroma yang bertanggung jawab atas lingkungan mikro, tidak seperti sel hematopoietik, tidak mampu melakukan migrasi dan berasal dari sumber lokal.

Namun demikian, hasil penelitian oleh Yu. Gerasimov dan rekan penulis (2001) menunjukkan bahwa penerapan trauma mekanik tidak hanya menyebabkan penataan ulang jaringan stroma yang tajam pada tulang yang disembuhkan, namun juga perubahan stroma yang signifikan pada tulang utuh yang jauh, yaitu ada respons sistemik. Jaringan stroma untuk trauma lokal. Dan saat menerapkan polytrauma - kuretase multipel - reaksi ini diperkuat dan diamati tidak hanya di tulang yang dioperasikan dan bagian tulang yang jauh, tetapi juga pada organ limfoid, khususnya di limpa. Mekanisme respon sistemik jaringan stroma sumsum tulang dan limpa terhadap trauma lokal dan polifrauma tetap tidak diketahui. Diasumsikan bahwa proses ini dikaitkan dengan efek faktor humoral yang dilepaskan oleh stroma mesenkhimal rongga meduler dari sumsum tulang. Kemungkinan memproduksi sumsum tulang dan limpa oleh sel stroma dari faktor humoral organonesspesifik yang bertanggung jawab atas proliferasi sel yang membentuk koloni fibroblas dibuktikan dengan data tentang aktivitas stimulasi koloni mereka dalam kultur sumsum tulang monolayer.

Dalam hal ini, perlu dicatat bahwa ketika pengenalan sistem sel progenitor mesenkim multipoten, turunan turunannya tidak hanya terpulihkan oleh sumsum tulang, tetapi juga oleh jaringan lain, yang digunakan, khususnya untuk terapi gen. Hal ini menunjukkan bahwa setelah pemberian intravena dalam jumlah besar MSC dengan genom jenis tikus liar dengan sel mutan kolagen gen Saya donor menggantikan hingga 30% dari sel-sel dalam tulang dan tulang rawan jaringan penerima, dan mesenchymal sel tikus batang transfeksi mensekresi IL-3 manusia, selama 9 bulan secara efektif mendukung hematopoiesis dalam kasus pemberian simultan mereka dengan sel induk hematopoietik manusia ke tikus dengan kekebalan tubuh.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Modifikasi genetik sel punca mesenkim

Di antara keberhasilan modifikasi genetik eksperimental MSC adalah transfeksi gen faktor IX pada MSC manusia dengan transfer sel transfeksi berikutnya ke tikus dengan tingkat imunodefisien, yang mengarah pada munculnya faktor antihemophilic B dalam darah selama 8 minggu setelah transplantasi. Dalam percobaan ini, modifikasi posttranslasional faktor IX dengan γ-glutamilil karboksilase dilakukan pada sel transfeksi. Transduksi MSC oleh vektor pengkodean retroviral faktor manusia IX kurang berhasil - pemberian selanjutnya sel-sel ini pada anjing dengan hemofilia B memberikan tingkat terapeutik faktor IX, yang mempertahankan intensitas hembusan koagulasi normal, hanya dalam 12 hari.

Transplantasi sel induk mesenkim ke dalam parenkim otak hewan telah menunjukkan bahwa sel imatur donor ditransformasikan baik dalam populasi neuron dan glia. Keterlibatan turunan neuronal dari jaringan mesenchymal donor yang sehat secara teoritis memungkinkan untuk memperbaiki kelainan genetik metabolisme otak pada pasien penyakit Gauchers dan gangguan metabolisme lipid, gangliosida atau karbohidrat lainnya.

Pencarian eksperimental untuk kondisi transdiferensiasi sel punca stroma sumsum tulang ke sel progenitor jaringan saraf dan hati berlanjut. Perhatian peneliti difokuskan pada kombinasi induser diferensiasi dan media pengkondisian khusus. Secara khusus, untuk isolasi kultur utama sel stroma, sel sumsum tulang dicuci dan disuspensikan kembali dalam medium kultur DMEM / F12 (1/1) dengan serum betina 10% janin ditaburkan pada kepadatan 200.000 / cm2. Setelah 24 jam, sel yang tidak patuh diangkat, dan sel mirip fibroblas yang menempel pada plastik dikultur selama satu minggu. Untuk diferensiasi sel stroma sumsum tulang ke dalam neuroblasts, media pengkondisian diperoleh dengan kultur tiga hari kultur fibroblast embrio primer, serta medium DMEM / F12 (1/1) dengan serum betina 2% dan menambahkan LNG 20 ng / ml atau 10-6 m asam retinoat (neuroinductors, yang digunakan untuk diferensiasi saraf tikus dan sel induk embrionik manusia). Diferensiasi sel stroma sumsum tulang menjadi sel prekursor hepatosit terjadi pada medium terkondisi yang diciptakan oleh kultur kultur hati tikus embrio tiga hari pada media DMEM / F12 (1/1) yang dilengkapi dengan serum janin bovine 10%.

Di sini perlu dicatat lagi bahwa sel-sel pembentuk koloni stroma sumsum tulang heteromorfik dan dapat dibagi menjadi dua jenis. Tipe pertama meliputi sel fibroblas-like yang membentuk sel filopodia dengan inti besar dan satu atau dua nukleol. Tipe kedua diwakili oleh sel kecil bentuk berbentuk gelendong. Dalam budidaya sel dari kedua jenis dalam media terkondisi yang diperoleh pada lapisan pengumpan fibroblas embrio primer tikus, sel-sel yang serupa dengan neuroblasts muncul pada hari ketiga dan keempat dalam kultur. Pada tahap ini mereka sering memiliki bentuk berbentuk spindel dengan satu atau dua proses panjang yang berakhir dengan filopodia. Piramid atau stellata sel dengan dendrit pendek kurang umum. Dendrit dari beberapa neuroblas memiliki ekstensi karakteristik (tunas pertumbuhan) dan bercabang di bagian distalnya, yang lain - kerucut pertumbuhan yang berbeda dengan filopodia, dimana pertumbuhan dendrit terjadi. Tanda morfologi serupa (ginjal dan kerucut pertumbuhan dengan filopodia), melekat pada neuroblasts, berdiferensiasi menjadi neuron, dijelaskan secara rinci dalam karya neurogenesis. Atas dasar ini, beberapa penulis menyimpulkan bahwa sel yang mereka deteksi dalam budaya adalah neuroblasts. Secara khusus, E. Shchegelskaya dan rekan penulis (2002), setelah mengkultur budaya utama sel stroma selama dua minggu di lingkungan yang terkondisi selama 3 sampai 4 hari, menetapkan bahwa sebagian sel berkembang biak, melestarikan keadaan yang tidak berdiferensiasi. Di luar, sel-sel seperti itu tampak seperti fibroblas dan diidentifikasi dalam budaya bersamaan dengan perbedaan neuroblasts. Sebagian besar sel (sekitar 80%) berada pada tahap diferensiasi yang berbeda ke dalam sel jaringan saraf, terutama ke neuron. Proses dendritik sel-sel ini saling berhubungan satu sama lain, sehingga secara bertahap sel terbentuk pada bagian substrat jaringan saraf dalam bentuk untai multiseluler panjang. Proses dendritik neuroblas tumbuh lebih lama, beberapa di antaranya 8-10 kali lebih tinggi dari pada panjang tubuh neuron itu sendiri. Secara bertahap proporsi sel piramida dan stellata meningkat. Dendrit sel stellata bercabang. Menurut penulis, diferensiasi sel piramidal dan stellate kemudian dibandingkan dengan bentuk berbentuk spindle sesuai dengan urutan tahap neurogenesis normal pada hewan. Akibatnya, para penulis menyimpulkan bahwa sel punca stroma sumsum tulang mengalami neurogenesis induksi, di mana secara in vitro dari neuroblasts ketiga jenis neuron utama terbentuk. Penderita sel saraf juga terdeteksi selama budidaya sel stroma sumsum tulang selama 3-4 hari di media dengan serum janin 2% dan LIF 20 ng / ml. Tetapi dalam kasus ini sel punca terbagi sangat lambat, diferensiasi neuroblas hanya terjadi pada 30% kasus dan mereka tidak membentuk jaringan syaraf tiruan. Sebagai induser diferensiasi sel saraf asam retinoat, penulis memperoleh kultur hingga 25-30% sel saraf dengan dominasi unsur glial - astrosit dan oligodendrosit. Neuron hanya menyumbang sepertiga dari semua sel saraf, meskipun keduanya diwakili oleh ketiga jenis ini: sel fusiform, piramidal, dan stellata. Pada hari ke 6 budidaya sel stroma dalam medium dengan asam retinoat, sel saraf menjadi lebih terdiferensiasi, dan akson ditemukan pada neuron piramida individu, yang pada neurotogenesis normal muncul lebih lambat daripada pembentukan proses dendritik. Menurut penulis, meskipun hasil yang rendah dari sel-sel saraf, metode merangsang asam retinoat memiliki kelebihan: astrosit dan oligodendrocytes dan myelinating mengoperasikan fungsi pakan selama pertumbuhan akson dan dendrit dan diperlukan untuk pembentukan jaringan saraf yang normal. Oleh karena itu, untuk memperbaiki situs yang rusak in vivo, lebih baik menggunakan suspensi neuron yang diperkaya dengan sel glial.

Pada rangkaian percobaan kedua, penulis mencoba menginduksi diferensiasi sel stroma sumsum tulang ke sel hati. Setelah budaya tiga hari dari sel stroma induk sumsum tulang di media dikondisikan diperoleh dengan menginkubasi tikus hepatosit embrio, besar, sel-sel berbentuk bulat telah ditemukan, sering dua-nuklir, inklusi sitoplasma dengan ukuran yang berbeda. Sel-sel ini berada pada tahap diferensiasi yang berbeda dan berbeda ukuran, jumlah nukleus dan inklusi di sitoplasma. Di sebagian besar sel ini, glikogen terdeteksi, berdasarkan mana penulis mengidentifikasi mereka sebagai sel progenitor hepatosit. Karena budaya tidak ada sel-sel yang terdeteksi Mirip dengan neuroblasts, diikuti dengan kesimpulan bahwa dalam media dikondisikan diperoleh kultur hepatosit embrio, tidak ada faktor diferensiasi sel-sel saraf dan, sebaliknya, ada faktor-faktor yang menginduksi diferensiasi sel-sel stroma sumsum tulang ke dalam sel progenitor hepatosit . Kesimpulannya, penulis menyarankan adanya pluripotency pada sel stroma sumsum tulang, karena mereka membedakan in vitro menjadi sel-sel jaringan saraf atau hati, tergantung pada media dan induser yang digunakan.

Dalam beberapa pekerjaan, diferensiasi sel stroma sumsum tulang ke dalam kardiomiosit, tulang rawan, tulang dan sel jaringan saraf memang ditunjukkan dengan benar. Ada informasi bahwa di antara sel-sel sumsum tulang ada populasi sel punca yang dapat berdiferensiasi menjadi hepatosit. Berdasarkan data ini, hasil percobaan di atas pada tikus masih dapat dianggap sebagai konfirmasi lain adanya sumsum tulang sel induk mesenkim pluripoten yang memiliki kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel dari jaringan organisme dewasa yang berbeda.

Transplantasi sel induk mesenkim

Dalam transplantasi klinis sel induk mesenchymal manusia dapat digunakan untuk ekspansi sel induk hematopoietik dan keturunan awal mereka prekommitirovannyh. Secara khusus, pengenalan sel-sel induk hematopoietik autologous dan pasien kanker MSC setelah kemoterapi dengan tinggi-mempercepat pemulihan neutrofil dan trombosit dalam darah perifer. Autologus dan transplantasi allogeneic sel induk mesenchymal digunakan untuk mengobati multiple myeloma, anemia aplastik, trombositopenia spontan - penyakit yang berhubungan dengan defek primer jaringan hematopoietik stroma. Efisiensi terapi sel dalam patologi hematologi dalam banyak kasus di atas, sedangkan pengenalan stroma dan sel induk hemopoietic, yang diwujudkan pengurangan masa pemulihan pasca operasi, darah, penurunan jumlah kematian akibat sel-sel kanker regional dan beredar kerusakan non-selektif di mana mati dan progenitor sendiri sel-sel pasien hematopoietik nya. MSC menjanjikan aplikasi dan sel-sel prekursor mesenchymal multipoten lain dalam praktek klinis karena relatif mudah mereka memperoleh aspirasi sumsum tulang, ekspansi budaya dan transfeksi gen terapeutik. Jadi untuk mengimbangi kerusakan jaringan lokal dapat menggunakan implantasi lokal sel prekursor mesenchymal multipoten dan disfungsi sistemik jaringan asal mesenchymal tidak dikecualikan pengenalan mereka ke dalam sirkulasi umum.

Lebih berhati-hati dalam penalaran mereka adalah penulis karya di mana prospek penggunaan MSC untuk transplantasi sistem dan sistemik lokal dianalisis dari sudut pandang biologi sel stroma. Sumsum tulang postnatal secara tradisional dianggap sebagai organ yang terdiri dari dua sistem utama dari garis sel yang jelas - jaringan hematopoietik yang sebenarnya dan stroma pendukung terkait. Oleh karena itu, sel induk mesenchymal dari sumsum tulang pada awalnya dianggap secara eksklusif sebagai sumber stroma dasar untuk produksi faktor regulasi lingkungan mikro hemopoietik. Kemudian perhatian para periset beralih untuk mempelajari peran MSC sebagai sumber stem jaringan skeletal. Data terakhir menunjukkan adanya kemungkinan tak terduga diferensiasi sel stroma sumsum tulang dengan pembentukan jaringan saraf atau otot. Dengan kata lain, sel induk mesenchymal menunjukkan plastisitas transgermal - kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi jenis seluler yang secara fenotip tidak terkait dengan sel-sel jaringan asli. Pada saat yang sama, beberapa aspek biologi sel stroma sumsum tulang tetap tidak jelas dan tidak terselesaikan baik secara biologi umum maupun dalam rincian individu, termasuk identifikasi, sifat, asal, perkembangan dan fungsi sel stroma sumsum tulang secara in vivo, serta potensi dan kemungkinan diferensiasi ex vivo yang diperbolehkan. Penggunaan terapeutik in vivo. Data yang diperoleh mengenai kemampuan potensial MSCs, serta hasil penelitian tentang potensi regeneratif sel induk lainnya, bertentangan secara tajam dengan dogma yang terbentuk dalam biologi.

Ketika dikultur dalam kondisi kepadatan rendah, sel stroma batang sumsum tulang membentuk koloni yang berbeda, yang masing-masing merupakan turunan dari sel prekursor tunggal. Persentase sel progenitor stroma pada sel sumsum tulang nukleasi, yang ditentukan oleh kemampuan untuk membentuk koloni, sangat bergantung pada kondisi budidaya dan spesies yang termasuk dalam MSC. Sebagai contoh, pada hewan pengerat, kehadiran sumsum tulang dan serum dalam budaya sel pengumpan yang diiradiasi mutlak diperlukan untuk produksi jumlah maksimum sel progenitor stroma, sedangkan pada manusia, efisiensi pembentuk koloni sel punca mesenkim tidak bergantung pada pengumpan atau media nutrisi. Jumlah faktor mitogenik yang diketahui yang merangsang proliferasi sel progenitor stroma terbatas. Ini termasuk PDGF, EGF, FGF, TGF-b, dan juga IGF1. Dalam kondisi kultur optimal, garis polyclonal MSC bertahan lebih dari 50 divisi sel, sehingga memungkinkan miliaran sel stroma sumsum tulang dari 1 ml aspirasinya.

Namun, populasi sel stroma sumsum tulang heterogen, yang memanifestasikan dirinya sebagai variabilitas dalam ukuran koloni, tingkat diferensiasi yang berbeda, dan berbagai morfologi seluler yang mencakup rentang dari fusiform fibroblas seperti sel flat besar. Dengan perkembangan tanaman tersebut setelah 20 hari, heterogenitas fenotipik juga dicatat. Beberapa koloni sangat diekspresikan oleh fosfatase alkali, yang lainnya sama sekali tidak mengungkapkannya, dan koloni tipe 3 bersifat positif fosfatase di daerah tengah dan fosfatase-negatif di daerah pinggiran. Koloni terpisah membentuk nodul jaringan tulang (awal mineralisasi matriks ditandai saat diwarnai dengan alizarin merah atau kalsium oleh Van-Koss). Di koloni lain, akumulasi lemak terjadi, diidentifikasi dengan pewarnaan G dengan minyak merah. Seringkali koloni sel punca mesenchymal membentuk tulang rawan yang diwarnai dengan warna biru alcyan).

Setelah transplantasi ektopik ke hewan percobaan, garis poliklonal MGK membentuk tulang ektopik dengan stroma retikuler yang terkait dengan myelopoiesis dan adiposit, dan lebih jarang lagi dengan jaringan kartilaginosa. Saat melakukan transplantasi garis sumsum tulang monoklonal, chimerism diamati pada beberapa kasus di mana tulang de novo terbentuk terdiri dari sel-sel tulang, mengandung stroma dan adiposit dari donor, sedangkan sel-sel dari garis hematopoietik dan sistem vaskular berasal dari penerima.

Hasil penelitian ini mengkonfirmasi sifat batang prekursor sumsum tulang stroma, dari mana diperoleh garis klon. Mereka juga secara bersamaan menunjukkan bahwa tidak semua kloning dalam sel budaya memang sel induk multipoten. Beberapa periset percaya dan kami berbagi pendapat mereka bahwa informasi yang paling andal tentang potensi nyata diferensiasi klon individu dapat diperoleh hanya secara in vivo setelah transplantasi, dan bukan dengan menentukan fenotipe turunannya secara in vitro. Ekspresi dalam kultur penanda fenotipik osteo-, chondro- atau adipogenesis (ditentukan oleh mRNA atau dengan teknik histokimia) dan bahkan produksi matriks mineral tidak mencerminkan tingkat pluripotency klon individu secara in vivo. Oleh karena itu, identifikasi sel induk pada kelompok sel stroma hanya mungkin terjadi posteriori, di bawah kondisi yang sesuai dari uji transplantasi biologis. Secara khusus, chondrogenesis sangat jarang diamati pada sistem transplantasi terbuka, sedangkan pembentukan tulang rawan tidak jarang terjadi pada sistem tertutup, seperti ruang difusi atau kultur mikromida sel stroma secara in vitro, di mana tekanan rendah oksigen lokal tercapai yang memfasilitasi pembentukan jaringan kartilaginosa. Oleh karena itu, bahkan teknik transplantasi, serta kondisi budidaya in vitro yang tidak spesifik, secara signifikan mempengaruhi kisaran diferensiasi MSC.

Transplantasi eksperimental dengan pengamatan kondisi eksperimental yang diberikan adalah standar emas untuk menentukan potensi diferensiasi sel stroma sumsum tulang dan elemen kunci identifikasi yang tepat. Secara historis, studi transplantasi sumsum tulang stroma sumsum tulang dihubungkan dengan masalah transplantasi sumsum tulang yang umum. Didirikan bahwa lingkungan mikro hemopoietik diciptakan oleh transplantasi sel stroma sumsum tulang dan menyediakan pengembangan jaringan hemopoietik ektopik di zona transplantasi. Asal usul lingkungan mikro dari donor, dan jaringan hematopoietik - dari inang memungkinkan kita untuk merawat tulang ektopik sebagai transplantasi sumsum tulang belakang yang benar. Transplantasi lokal sel stroma sumsum tulang mempromosikan koreksi efektif terhadap cacat tulang, lebih menonjol daripada regenerasi reparatif spontan. Beberapa studi praklinis pada model eksperimental telah secara meyakinkan menunjukkan kemungkinan penggunaan transplantasi sumsum tulang stroma sumsum tulang pada ortopedi, walaupun penelitian dan analisis yang paling menyeluruh diperlukan untuk mengoptimalkan teknik ini, bahkan dalam kasus yang paling sederhana sekalipun. Secara khusus, kondisi optimal untuk perluasan sel stroma osteogenik ex vivo belum terbentuk, struktur dan komposisi pembawa ideal tetap tidak terpakai, serta jumlah sel yang diperlukan untuk regenerasi tulang massal.

Selain penggunaan sel stromal sumsum tulang ex vivo yang direproduksi untuk tujuan regenerasi jaringan asal mesenkim, plastisitas MSC yang tidak ortodoks membuka potensi penggunaannya dalam regenerasi sel saraf atau dalam pengiriman produk gen ke sistem saraf pusat. Pada prinsipnya, ini menyederhanakan terapi seluler dalam kekalahan sistem saraf, karena tidak perlu mendapatkan sel induk saraf autologous dari manusia. Hal ini dilaporkan pada kemungkinan menggunakan sel sumsum tulang untuk pembentukan kardiomiosit dan sel prekursor myogenic sebagai asal stromal dan ekstrinsik yang sesungguhnya.

Percobaan sedang dilakukan pada transplantasi sistemik sel stroma sumsum tulang untuk pengobatan penyakit kerangka umum. Tidak ada keraguan bahwa sel stroma sumsum tulang mewakili populasi yang bertanggung jawab atas kelainan genetik pada penyakit kerangka, yang digambarkan dengan baik oleh transfer vektor dari informasi genetik ini melalui sel-sel ini, yang mengarah pada pembentukan jaringan tulang patologis pada hewan percobaan. Namun, kemampuan sel stroma untuk menanam, tumbuh, berkembang biak dan berdiferensiasi di tulang kerangka setelah diperkenalkan ke aliran darah umum belum terbukti.

Hal ini sebagian disebabkan oleh kenyataan bahwa dalam prosedur standar transplantasi sumsum tulang, stroma tidak ditransplantasikan bersama dengan jaringan hematopoietik, oleh karena itu, kriteria yang ketat untuk mengevaluasi keberhasilan penggunaan sel stroma yang dikelola secara sistemik belum dikembangkan. Harus diingat bahwa keberadaan gen penanda dalam ekstrak jaringan atau isolasi dalam budaya sel yang berasal dari donor tidak menunjukkan adanya engraftment sel, namun hanya kelangsungan hidup mereka. Bahkan suntikan intra-arteri sel stroma sumsum tulang ke anggota badan tikus dapat menyebabkan hasil kerja keras hampir nol, terlepas dari fakta bahwa sel-sel asal donor ditemukan dalam jumlah besar di dalam jaringan mikrovaskular sumsum tulang. Sayangnya, sel semacam itu biasanya digambarkan sebagai "engrafted" hanya berdasarkan hasil penentuan gen penanda gen di bawah kondisi budaya ex vivo. Selain itu, perlu memberikan bukti meyakinkan tentang integrasi jangka panjang di jaringan sel yang terdiferensiasi dan berfungsi secara aktif dari sumber donor. Dalam banyak karya yang diterbitkan, di mana dilaporkan tentang engraftment sel stroma sumsum tulang dalam kerangka, kurangnya data yang jelas dari jenis ini sangat mencolok. Namun demikian, perlu dicatat bahwa dalam beberapa eksperimen yang benar pada hewan, bagaimanapun, adalah penggunaan sel progenitor stroma yang terbatas namun nyata setelah administrasi sistemik mereka terbentuk.

Data ini konsisten dengan hasil penelitian kemungkinan mengantarkan sel prekursor sumsum tulang myogenic ke otot melalui sistem vaskular. Namun, tidak boleh dilupakan bahwa jaringan kerangka dan otot terbentuk pada perkembangan dan pertumbuhan berdasarkan pergerakan sel ekstravaskular yang menggunakan proses migrasi yang tidak melibatkan sirkulasi dalam darah. Jika benar-benar ada jalur peredaran darah independen untuk pengiriman sel prekursor ke jaringan fase padat, mungkinkah memungkinkan adanya sel progenitor mesenkim yang secara fisiologis beredar? Apa asal mula sel-sel ini dalam organisme berkembang dan pascalahir, dan bagaimana cara menembus dinding vaskular? Solusi dari isu-isu ini mutlak diperlukan dan memerlukan analisis preklinis yang paling menyeluruh. Bahkan setelah jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini ditemukan, aspek kinetik bermasalah yang terkait dengan pertumbuhan kerangka dan remodeling jaringan ikat tetap tidak terpecahkan. Pada saat yang sama, pengobatan gangguan osteogenesis dengan mengganti seluruh populasi sel progenitor skeletal yang bermutasi dengan sel stroma sehat tampaknya merupakan perspektif klinis yang nyata. Dalam kasus ini, zona lokal fraktur atau deformasi karena osteogenesis patologis, serta perubahan destruktif pada jaringan tulang, dapat dikoreksi dengan cara berbudaya pada sel induk stroma in vitro. Oleh karena itu, arah penelitian masa depan harus difokuskan pada masalah transformasi atau koreksi genetik sel progenitor osteogenik bermutasi autovoleptik ex vivo.

Rekayasa genetika sel, jangka pendek atau permanen, telah menjadi dasar biologi seluler dan molekuler, sumber banyak penemuan ilmiah mengenai peran protein individu dalam metabolisme sel in vitro dan in vivo. Penggunaan teknologi molekuler untuk memperbaiki patologi herediter dan penyakit manusia sangat menjanjikan untuk pengobatan praktis, karena sifat sel induk stroma sumsum tulang memungkinkan pengembangan skema transplantasi unik untuk koreksi penyakit genetik kerangka. Dalam kasus ini, sel progenitor mesenchymal dapat diperoleh dengan mudah dari penerima di masa depan, mereka dapat menerima manipulasi genetik dan mampu berkembang biak dalam jumlah besar dalam waktu singkat. Penggunaan sel induk mesenchymal menghindari keterbatasan dan risiko yang terkait dengan penyampaian materi informasi genetik secara langsung kepada pasien melalui struktur vektor vestuvous. Strategi semacam itu dapat diterapkan pada sel induk embrionik, namun sel stroma sumsum tulang postnatal autologous adalah bahan yang lebih disukai, karena administrasinya tidak memasukkan komplikasi pasca transplantasi imunologis yang mungkin terjadi. Untuk mencapai efek jangka pendek, misalnya, untuk mempercepat regenerasi tulang, metode yang paling optimal adalah modifikasi genetik sel punca mesenchymal dengan menggunakan electropores, fusi kimia, lipofeksi, plasmid dan konstruksi adenoviral. Secara khusus, transfeksi virus ke dalam sel stroma BMP-2 sumsum tulang efektif dalam mempercepat regenerasi tulang pada poltrauma eksperimental. Penciptaan struktur vektor adenoviral lebih disukai karena tidak adanya toksisitas. Namun, modifikasi genetik sel stroma sumsum tulang dalam kasus ini ditandai dengan stabilitas yang sangat rendah. Selain itu, sel stromal sumsum tulang yang diubah normal memerlukan penggunaan pembawa vektor informasi genetik 10 kali lebih menular daripada jenis sel lainnya, yang secara signifikan meningkatkan persentase kematian sel yang tertransfeksi.

Untuk pengobatan penyakit resesif yang disebabkan oleh rendahnya atau nol aktivitas biologis gen tertentu, modifikasi sel stem mesenchymal yang berkepanjangan atau permanen diperlukan, yang memerlukan penggunaan virus, retrovirus, lentivirus, atau chimera adeno-retroviral yang adeno. Situs transportasi virus ini mampu membawa transfeksi DNA besar (sampai 8 kb). Dalam literatur ilmiah, informasi telah muncul mengenai aktivitas biologis eksogen dari sel stroma sumsum tulang yang dipancar dengan konstruksi retroviral yang mengkodekan sintesis molekul peraturan dan penanda - IL-3, CD2, faktor VIII, dan enzim yang terlibat dalam sintesis L-DOPA. Namun dalam karya-karya ini penulis menunjukkan sejumlah keterbatasan yang harus diatasi sebelum penerapan praktis teknologi ini dimulai. Masalah pertama adalah mengoptimalkan proses modifikasi MCK ex vivo. Diketahui bahwa proliferasi sel stroma sumsum tulang yang lama (3-4 minggu) secara in vitro mengurangi transfeksi mereka. Pada saat yang sama, beberapa siklus transfusi diperlukan untuk mencapai tingkat modifikasi genetik MSC yang tinggi. Masalah kedua terkait dengan durasi ekspresi gen terapeutik, yang belum melebihi empat bulan. Penurunan alami dalam ekspresi gen yang efektif adalah karena inaktivasi promotor dan kematian sel yang dimodifikasi. Dalam transfer prospek umum informasi genetik dengan menggunakan sel induk mesenchymal hasil studi pendahuluan menunjukkan perlunya optimasi lebih lanjut dari metode transfeksi ex vivo, memilih promotor yang memadai mengatur aktivitas biologis dalam arah yang benar, dan meningkatkan kemampuan sel-sel sumsum stroma tulang dimodifikasi untuk memperbaharui diri in vivo setelah transplantasi. Perlu dicatat bahwa penggunaan desain retroviral untuk memodifikasi sel stroma sumsum tulang ke arah yang benar tidak selalu memerlukan engraftment mandatory mereka. Sel induk mesenkim yang ditransfeksi dapat melakukan fungsi korektif dengan latar belakang tinggal yang stabil dan tanpa pembentukan fisik aktif yang wajib dan berfungsi di jaringan ikat. Dalam kasus ini, mereka harus dianggap sebagai pompa mini biologis, yang menghasilkan faktor in vivo, defisit yang menentukan manifestasi patologi genetik.

Penggunaan tulang sel sumsum stroma diubah untuk pengobatan penyakit genetik dominan yang ditandai dengan ekspresi gen atau aktivitas biologis patologis yang abnormal, jauh lebih bermasalah karena dalam hal ini perlu untuk memblokir transfer atau penjualan informasi genetik terdistorsi. Salah satu metode rekayasa genetika adalah rekombinasi homolog sel induk embrionik untuk menciptakan hewan transgenik. Namun, tingkat yang sangat rendah rekombinan homolog, dikombinasikan dengan masalah identifikasi, pemisahan dan perluasan rekombinan tersebut tidak mungkin untuk mempromosikan meluasnya penggunaan teknik ini dalam waktu dekat, bahkan jika pengembangan metode teknologi baru. Pendekatan kedua untuk terapi gen didasarkan pada dominan patologi koreksi otomatis dari DNA rusak mutasi genetik dapat dikoreksi oleh pengenalan DNA eksogen dengan urutan yang diinginkan (oligonukleotida DNA pendek, atau chimeric oligonukleotida RNA / DNA) yang mengikat homolognya dalam genom yang rusak. Perwujudan ketiga memberikan kunci transmisi informasi patologis yang dicapai melalui penggunaan oligonukleotida yang dirancang khusus yang mengikat gen tertentu untuk membentuk struktur heliks terner, yang tidak termasuk kemungkinan transkripsi.

Terlepas dari kenyataan bahwa koreksi penyakit genetik pada tingkat genom tetap merupakan metode terapeutik yang paling optimal dan paling disukai, mRNA juga merupakan vektor yang menjanjikan (bahkan mungkin lebih mudah diakses) karena menghalangi gen negatif yang dominan. Untuk tujuan menghambat translasi dan / atau peningkatan degradasi mRNA, molekul protein dengan antisense oligonucleotide atau urutan lengkap yang menghalangi pengikatan mRNA ke aparatus biosintesis sel telah lama digunakan. Selain itu, RNA beruntai ganda menginduksi degradasi cepat mRNA, mekanisme yang masih belum jelas. Namun, tidak mungkin hanya penghilangan mRNA yang ditranskripsi dari alel mutan dengan mutasi pendek atau tunggal akan memudahkan ekspresi alel mRNA normal. Alternatif lain adalah penggunaan ribbon dan hiasan martil martil, yang mampu mengikat daerah mRNA yang sangat spesifik, diikuti dengan induksi pembelahan dan inaktivasi selama terjemahan. Saat ini, kemungkinan penggunaan metode ini dalam pengobatan osteogenesis patologis sedang dipelajari. Terlepas dari apa sebenarnya target - elemen genom atau sitoplasma keberhasilan teknologi terapi gen baru akan ditentukan oleh efisiensi masuknya reagen dalam sel sumsum stroma tulang ex vivo, pilihan yang optimal dari vektor tertentu dan kemampuan yang stabil sel batang mesenchymal mengungkapkan faktor-faktor yang diinginkan in vivo.

Dengan demikian, penemuan sel induk mesenchymal dengan sifat tak terduganya menciptakan skema konseptual baru untuk pengembangan garis sel. Namun, penelitian interdisipliner lebih lanjut diperlukan untuk memahami peran biologis sel induk stroma, sifatnya, kemampuan mereka untuk mentransdifferentiasi atau dedifferentiate, signifikansi fisiologisnya dalam proses perkembangan embrio, pertumbuhan pascakelahiran, pematangan dan penuaan, dan pada penyakit manusia.