Pekerjaan eksperimental pada transplantasi keratinosit alogenik pada bekas luka tikus putih yang dibuat secara artifisial

Keinginan untuk menggunakan potensi seluler dan kebutuhan untuk menemukan metode baru yang efektif untuk memperbaiki penampilan estetika bekas luka memunculkan ide untuk mencoba mempelajari kemungkinan transplantasi keratinosit ke permukaan bekas luka.

Untuk membuktikan kemungkinan penggunaan kultur keratinosit untuk memperbaiki tampilan bekas luka, dilakukan penelitian eksperimental pada tikus laboratorium putih, yang permukaan bekas lukanya dibuat. Model bekas luka tikus diperoleh sebagai hasil penyembuhan luka yang ditimbulkan secara artifisial di punggung, di sepanjang tulang belakang. Tikus dipotong menjadi potongan kulit yang identik, berukuran 2x3 cm. 2,5 bulan setelah operasi "pemodelan bekas luka", tikus menjalani dermabrasi (pengangkatan lapisan atas bekas luka menggunakan termokaustik) dan keratinosit alogenik ditransplantasikan, diisolasi dari kulit anak tikus 2-4 hari setelah lahir.

Isolasi dan pembudidayaan sel epidermis tikus dilakukan di laboratorium teknologi sel Institut Sitologi Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia menggunakan teknologi berikut.

Kulit dicuci dalam larutan garam Hank yang mengandung 200 U/ml gentamisin dan dipotong kecil-kecil, dengan luas 0,2-0,5 cm2 ^. Potongan kulit diinkubasi dalam larutan dispase 0,5% dalam larutan penyangga fosfat garam seimbang pada suhu 37°C selama 1 jam. Potongan kemudian dipindahkan ke larutan garam penyangga fosfat Dulbecco dan epidermis dipisahkan dari dermis. Epidermis diinkubasi dalam larutan tripsin 0,125% selama 10-15 menit dengan pengadukan pada kecepatan 50 rpm, setelah itu aksi enzim dihentikan dengan menambahkan 5% serum sapi janin. Sepertiga dari suspensi sel yang dihasilkan digunakan dalam bentuk murni untuk salah satu pilihan transplantasi ke bekas luka, sepertiga kedua ditumbuhkan pada lapisan film domestik biokompatibel "Polypor", dan yang ketiga - pada cawan Petri tanpa substrat. Operasi dermabrasi pada bekas luka yang dihasilkan pada tikus dengan transplantasi sel epidermis tikus berikutnya ke atasnya dilakukan di bawah anestesi eter menggunakan kauter termal.

Pada kelompok tikus pertama, setelah dermabrasi, potongan kain kasa steril diletakkan pada permukaan bekas luka yang telah dipoles, dicuci dengan larutan fisiologis, dan dikeringkan, yang kemudian dioleskan suspensi epidermosit tikus alogenik yang dikocok pada konsentrasi 1,5 juta sel per 1 ml (menurut Institut Sitologi). Potongan kain kasa tersebut diletakkan pada bekas luka yang telah dipoles sehingga sel-selnya berada pada permukaan bekas luka. Perban dari beberapa lapis kain kasa diletakkan di atasnya, yang dijahit ke tepi bekas luka.

Bagian dari suspensi sel yang diperoleh disemai di cawan Petri pada film Polypore steril yang dipotong sesuai bentuk cawan, bagian lainnya - pada cawan Petri tanpa film. Kultivasi dilakukan dalam media FAD, yang terdiri dari campuran media DMEM dan F12 dengan perbandingan 3:1. dengan penambahan 10% serum sapi janin, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0,5 μg / ml hidrokortison hemisuccinate (Sigma). 10 μg / ml faktor pertumbuhan epidermal EGF (Institut Sitologi RAS, St. Petersburg). Kelompok tikus kedua dan ketiga, masing-masing 7 individu, dioperasi 6 hari setelah yang pertama. Pada saat ini, lapisan berlapis-lapis terbentuk dari suspensi keratinosit yang disemai di cawan Petri, yang ditransplantasikan ke tikus. Kelompok kedua ditransplantasikan dengan epidermosit pada film, yang ketiga - dengan lapisan berlapis-lapis tanpa substrat. Setelah 7 hari, lapisan multilapis keratinosit alogenik (MPALK) yang diperoleh, yang disemai pada film "Polypore", ditransplantasikan sebagai kultur langsung ke permukaan luka. Di bagian atas, film, untuk menghindari robeknya, difiksasi dengan perban kasa multilapis dan dijahit ke kulit tikus.

Sebelum mentransplantasikan keratinosit ke kelompok ketiga tikus yang tumbuh tanpa substrat, PAC dipisahkan dari dasar cawan Petri dengan memperlakukannya dengan dispase, yang memiliki kemampuan untuk secara selektif mengganggu ikatan dermal-epidermal. Ketika bekerja pada lapisan berlapis-lapis, dispase mengganggu hubungan sel-sel lapisan basal dengan dasar cawan Petri dan memiliki efek yang jauh lebih kecil pada hubungan antar sel, yang memungkinkan untuk "menghilangkan" lapisan tersebut sepenuhnya. Pelepasan lapisan sel berlapis-lapis dengan dispase dilakukan sebagai berikut. Media transpor dikeringkan dari cawan Petri, lapisan sel dicuci tiga kali dengan media nutrisi yang mengandung antibiotik, khususnya gentamisin (0,2 mg/ml). Lapisan berlapis-lapis diisi dengan larutan dispase 0,125% ("Sigma") dan ditempatkan dalam termostat, di mana mereka diinkubasi pada t=37°C selama 20-30 menit. Munculnya pinggiran putih yang terkelupas di sepanjang pinggiran lapisan merupakan indikator dimulainya proses pemisahannya dari tepi dan dasar cawan Petri. Beberapa menit setelah dimulainya proses pemisahan, larutan dispase dikeringkan, lapisan epitel dicuci 2-3 kali dengan medium. Sepotong balutan luka steril "Lita-color" yang dipotong seukuran cangkir dioleskan ke permukaan lapisan epidermis, di mana lapisan yang dipisahkan oleh dispase, yang juga dikupas dari dasar cangkir dengan spatula, direkatkan. Dengan menggunakan pinset mata, lapisan tersebut bersama dengan lapisan serbet "Lita-color" (Rusia) disobek dari dasar cawan Petri dan dipindahkan dengan hati-hati ke permukaan bekas luka yang telah disiapkan. Serbet "Lita-color" mengandung gentamisin dan eksolin (ekstrak kolagen), yang bila dibasahi dengan sisa media pertumbuhan dan kemudian dengan larutan fisiologis, akan membengkak dan menjadi pembalut luka modern, memberikan perlindungan yang baik dari infeksi eksternal dan penyembuhan yang cepat karena strukturnya yang menyerap kelembapan.

Perban kasa berlapis-lapis diaplikasikan pada film Polypore dan serbet warna Lita dan dijahit ke kulit tikus untuk fiksasi yang lebih kuat. Setiap tikus ditempatkan di kandang terpisah untuk menciptakan kondisi optimal bagi pemeliharaan dan pencangkokan keratinosit yang ditransplantasikan. Perban tikus yang ditransplantasikan suspensi dan lapisan epidermosit berlapis-lapis yang diambil dengan dispase dibasahi dengan garam steril beberapa kali sehari untuk menciptakan kondisi yang paling menguntungkan bagi pencangkokan sel. Mengingat film Polypore kedap air, perban tikus pada kelompok kedua tidak dibasahi, yang merupakan salah satu keuntungan dibandingkan transplantasi tanpa film. Perban dilepas setelah 10 hari. Gambaran klinis bekas luka setelah transplantasi sel sedikit berbeda dari bekas luka tanpa transplantasi, kecuali warnanya yang lebih merah muda (karena dermabrasi) dan pengelupasan yang lebih besar. Fakta ini menunjukkan bahwa segera setelah pembalut luka terlepas dengan MPC, tidak terjadi perubahan pada bekas luka.

Mengambil bahan biopsi dari tikus.

Setelah 1, 2, 5, dan 9 bulan setelah transplantasi keratinosit alogenik tikus ke bekas luka tikus putih yang dipoles, bahan diambil untuk pemeriksaan histologis, sitomorfologis, dan mikroskopis elektron. Sampel kulit tikus normal dan bekas luka tanpa transplantasi sel diambil sebagai kontrol. Anestesi tikus dilakukan dengan menggunakan anestesi eter.

Setelah anestesi, potongan jaringan parut diambil dari area yang ditandai tempat keratinosit ditransplantasikan menggunakan tusuk biopsi berdiameter 2 mm dan ditempatkan dalam larutan glutaraldehida 2,5% untuk menyiapkan bahan untuk pemeriksaan mikroskopis elektron. Potongan jaringan yang diambil untuk pemeriksaan histologis ditempatkan dalam larutan formalin netral 10%, diikuti dengan melewatkannya ke dalam alkohol dan menanamkannya dalam parafin, diikuti dengan pemotongan bagian yang sangat tipis dan melihatnya dalam mikroskop optik cahaya.

Kontrol I. Kulit tikus normal.

Untuk melihat perbedaan antara gambaran mikroskopis kulit tikus yang mengalami perubahan jaringan parut normal dan jaringan parut pada waktu-waktu tertentu setelah transplantasi MPC, foto-foto dan deskripsinya diperlihatkan pada semua tahap penelitian ini.

Epidermis kulit normal terdiri dari 7-9 lapisan sel. Stratum korneum memiliki ketebalan sedang. Di beberapa tempat terdiri dari 6-8 lapisan sisik tanduk. Lapisan basal diwakili oleh sel-sel silindris dengan inti yang besar, ringan, berbentuk teratur dan beberapa nukleolus. Hubungan desmosomal antara sel-sel dan dengan membran basal diekspresikan dengan jelas. Di bawah membran basal yang terdefinisi dengan baik, yang memiliki pertumbuhan kecil di lapisan subepidermal, sejajar dengannya terdapat bundel halus serat kolagen dan elastin, di antaranya terdapat fibroblas memanjang, pembuluh kecil. Di lapisan yang lebih dalam, bundel serat kolagen dan elastin terletak di berbagai arah. Di antara mereka terdapat banyak pembuluh dengan dinding tipis dengan kaliber yang sama, elemen seluler (fibroblas, sel mast, leukosit). Sejumlah besar folikel rambut, kelenjar sebasea.

Kontrol 2. Bekas luka tikus, umur 2 bulan.

Gambaran klinis. Bekas luka berwarna merah muda pucat, mengelupas, dan masih ada kerak di beberapa tempat. Luasnya berkurang karena kontraksi serat kolagen dan menjadi sekitar 3,0-3,5 cm ^. Tidak ada pelengkap kulit.

Gambaran mikroskopis. Epidermis terdiri dari 3-5 lapis sel, terlipat, diwakili oleh sel basal bulat, satu baris subulat, 1-2 baris granular dengan butiran keratohyalin di lapisan atas, terdapat area edema intraseluler. Stratum korneum berubah tidak merata dari sangat tipis menjadi menebal. Lipatan parut terlihat karena (kontraksi) jaringan parut. Lipatan menembus ke lapisan papiler dan menciptakan kesan papila. Batas antara epidermis dan dermis adalah garis lurus. Membran dasar tidak dilacak di mana-mana. Di bagian bawah subepidermal dan lapisan yang lebih dalam terdapat pembuluh dengan dinding tebal dan longgar, banyak yang kosong, dengan stasis. Di sekitar pembuluh terdapat akumulasi makrofag, fibroblas. Makrofag mengelilingi eritrosit yang dilepaskan dari kapiler dan memfagositosisnya. Di lapisan yang lebih superfisial terdapat kapiler kecil. Di bawah epidermis, serat kolagen terletak longgar. Pada lapisan jaringan parut yang lebih dalam terdapat berkas-berkas serat kolagen kasar, di antaranya terdapat banyak fibroblas.

Bekas luka tikus satu bulan setelah transplantasi keratinosit tikus.

Gambaran klinis. Bekas luka berwarna merah muda, luasnya berkurang, terutama diameternya, dan rata-rata 2,5-3 cm ². Tidak ada rambut dan kelenjar sebasea.

Data pemeriksaan mikroskopis bahan yang diperoleh dari tikus dengan transplantasi MPaLK pada film dan MPaLK tanpa substrat secara praktis identik. Namun, secara teknis, bekerja dengan MPaLK tanpa substrat jauh lebih rumit dan melelahkan daripada saat menumbuhkan MPaLK pada substrat, oleh karena itu, dalam mempelajari lebih lanjut masalah transplantasi keratinosit ke bekas luka, kami menggunakan cambric multilayer sebagai dasar untuk menumbuhkan ("substrat").

Gambaran mikroskopis. Terlihat penebalan epidermis hingga 15-20 lapisan, hampir di bagian tengah keratinosit berbentuk sempit, memanjang, vertikal, dan tersusun rapat. Sel basal terletak pada garis yang tidak rata. Inti selnya ringan, besar, membulat dengan satu atau dua nukleolus, yang menunjukkan aktivitas sintetik dan proliferatifnya yang tinggi. Batas antara epidermis dan dermis berupa garis lurus. Lapisan spinosus berkembang dengan baik, terdiri dari 3-5 lapisan sel membulat, terdapat 2 sel nukleolus.

Tepat di bawah membran dasar terdapat berkas-berkas serat kolagen tipis yang rapat, sejajar dengannya terdapat sejumlah besar pembuluh darah kosong, serat kolagen yang lebih dalam lebih kasar, terkumpul dalam berkas-berkas rapat. Banyak fibroblas besar, sel mast (2-3 dalam bidang pandang), makrofag, leukosit, dan pembuluh darah kosong, yang dindingnya mengendur, di sekitarnya terdapat serat kolagen yang longgar. Di beberapa pembuluh darah terdapat stasis, diapedesis elemen yang terbentuk. Di sekitar pembuluh darah terdapat fibroblas, limfosit tunggal. Tidak ada pelengkap kulit.

Ketika mentransplantasikan suspensi keratinosit ke bekas luka yang dipoles, gambaran mikroskopisnya berbeda dari yang sebelumnya. Pada sebagian besar hewan, epidermis tipis dan terdiri dari 5-6 lapisan sel. Lapisan bawah terdiri dari sel-sel berbentuk poligonal tidak beraturan dengan inti berbentuk bulat tidak beraturan. Keadaan lapisan subepidermal mirip dengan keadaannya pada kelompok hewan tanpa transplantasi MPALK.

Dalam kasus ini, kita dapat berbicara tentang penundaan dalam proses yang menyertai transplantasi sel, atau tentang hilangnya banyak sel yang ditransplantasikan dalam bentuk suspensi. Oleh karena itu, kesimpulan dibuat tentang ketidakpraktisan koreksi jaringan parut dengan mentransplantasikan keratinosit dalam bentuk suspensi.

Bekas luka tikus 2 bulan setelah transplantasi keratinosit tikus.

Gambaran klinis. Bekas luka tampak tipis dan halus. Di beberapa tempat, terlihat bintik-bintik mengelupas dan bersisik.

Gambaran mikroskopis. Stratum korneum menebal, di beberapa tempat terjadi hiperkeratosis. Epidermis menebal, terdiri dari 12-20 baris sel. Batas antara epidermis dan dermis berupa garis lurus. Serat kolagen halus di bawah epidermis terletak cukup rapat. Di lapisan jaringan parut yang lebih dalam, serat-serat tersebut terkumpul dalam berkas-berkas besar yang kasar. Di lapisan subepidermal, muncul pembentukan pembuluh darah baru. Di lapisan jaringan parut yang lebih rendah, terdapat banyak pembuluh darah kosong yang terletak sejajar dengan permukaan epidermis. Fibroblas besar tersebar merata di ketebalan jaringan parut, terdapat makrofag raksasa, bercabang banyak, dan banyak.

Bekas luka tikus 5 bulan setelah transplantasi sel epidermis tikus.

Gambaran klinis. Bekas luka tampak rata, halus tanpa mengelupas, terdapat rambut tunggal, kepadatannya lebih besar di pinggiran bekas luka, yang menunjukkan pertumbuhan folikel rambut ke dalam bekas luka dan pembentukan folikel rambut baru. Luas bekas luka terus berkurang.

Gambaran mikroskopis. Epidermis masih tebal (15-20 lapisan, di beberapa tempat hingga 30) di lapisan atas terisi butiran keratohyalin. Membran dasar terlihat jelas. Di bawahnya, serat kolagen terletak longgar. Di lapisan bawah, kolagen lebih kuat dan padat. Ada banyak kapiler di antara berkas kolagen. Di lapisan atas, jumlah pembuluh yang ditinggalkan telah berkurang. Persimpangan epidermis dan dermis sedikit bergelombang. Di beberapa tempat, ada pertumbuhan epidermis yang dalam di jaringan parut. Pembuluh darah yang baru terbentuk terlihat di antara serat kolagen. Folikel rambut tunggal dan kelenjar sebasea muncul.

Bekas luka tikus 9 bulan setelah transplantasi sel MPA epidermis tikus.

Gambaran klinis. Bekas luka menjadi jauh lebih kecil dibandingkan periode sebelumnya, luasnya rata-rata sekitar 1,5-2,0 cm ². Bekas luka ditutupi rambut halus secara tidak merata, terutama di bagian tepi. Masih ada pengelupasan halus kecil.

Gambar mikroskopis.

Epidermis menjadi lebih tipis, diwakili oleh 6-8 baris sel, menyerupai epidermis kulit tikus normal dalam struktur, hanya kepadatan selnya 1 mm lebih tinggi dan lebih kecil. Lapisan basal terdiri dari sel-sel bulat-silinder kecil. Membran basal diekspresikan dengan baik, hemidesmosom terlihat jelas. Kehadiran pertumbuhan epidermis di lapisan subepidermal dicatat. Lapisan papiler diekspresikan di sepanjang bekas luka. Fakta-fakta ini menunjukkan bahwa pada saat ini adhesi keratinosit yang ditransplantasikan telah menjadi jauh lebih kuat dengan jaringan parut di bawahnya. Oleh karena itu, perawatan bekas luka pada orang dengan transplantasi MPALK 9 bulan setelah transplantasi MPC dapat dilakukan secara tradisional. Di bawah epidermis, serat kolagen lebih halus daripada di lapisan dalam. Banyak pembuluh telah muncul, terutama yang superfisial. Dinding pembuluh yang lebih besar menebal. Folikel rambut dan kelenjar sebasea dalam jumlah besar. Gambaran mikroskopis menyerupai jaringan seperti dermal.

Hasil kerja percobaan dan pembahasannya.

Dalam proses kerja ini, keratinosit dalam berbagai bentuk ditransplantasikan ke bekas luka kulit tikus yang dibuat secara artifisial setelah operasi dermabrasi - pada penutup luka, sebagai suspensi pada kain cambric, dan sebagai lapisan multilayer tanpa substrat. Pekerjaan ini dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh data morfologi tentang efek keratinosit alogenik yang ditransplantasikan pada bekas luka, serta menentukan pilihan transplantasi yang optimal.

Ketiga metode transplantasi ini terbukti dapat dilakukan, tetapi transplantasi MPAC tanpa substrat merupakan prosedur yang sangat padat karya, yang mana MPAC dapat terluka, yang memengaruhi hasil transplantasi. Selain itu, metode transplantasi ini tidak memungkinkan untuk bekerja pada permukaan yang besar.

Transplantasi suspensi keratinosit merupakan metode yang jauh lebih hemat biaya, tidak memerlukan pembudidayaan sel jangka panjang, dan sederhana dalam versi yang kami usulkan dengan menggunakan blanko cambric steril, yang ukurannya sesuai dengan ukuran bekas luka. Keterlambatan efek terapeutik saat mentransplantasi suspensi sel sekitar satu bulan dibandingkan dengan MPC pada pelapis luka bukanlah hal yang signifikan dengan durasi perawatan selama berbulan-bulan. Diketahui bahwa saat MPC ditransplantasikan ke pasien luka bakar, transformasi struktur kulit terjadi secara bertahap dan selama beberapa tahun. Transplantasi kultur keratinosit pada pelapis luka merupakan metode yang paling nyaman dan menjanjikan, tetapi juga jauh lebih mahal. Selain itu, saat ini diperlukan pencarian opsi pelapis yang lebih canggih yang harus fleksibel, higroskopis, memiliki sifat bakteriostatik atau bakterisida, dan netral secara biologis terhadap sel. Film "Polypor" - versi antara dari lapisan luka film domestik, meskipun memiliki beberapa ketidaksempurnaan, memungkinkan kami untuk mempelajari dalam percobaan transplantasi keratinosit tikus pada bekas luka dan menarik kesimpulan tentang efektivitas arah perawatan bekas luka ini.

Para penulis yang mentransplantasikan MPC ke luka bakar mencatat bahwa selama minggu pertama setelah mentransplantasikan lapisan keratinosit berlapis-lapis ke luka yang telah disanitasi, epidermis menebal dan terlapisi. Semua lapisan epidermis terlihat jelas. Menariknya, jumlah lapisan sel dalam transplantasi tersebut 10-30% lebih banyak daripada dalam biopsi kulit. Para penulis mencatat munculnya butiran keratohyalin pada hari ke-5 setelah transplantasi MPC, dan membran basal serta hemidesmosom - sudah pada hari ke-3.

J.Rives dkk. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM dkk. (1998) menemukan bahwa pada tahap awal setelah transplantasi MPC kepada pasien dengan cacat kulit ketebalan penuh setelah luka bakar, hubungan antara dermis dan epidermis sangat lemah dan merupakan garis lurus, lapisan papiler tidak ada. Pada akhir bulan ke-2, papila dangkal dan pelengkap kulit mulai terbentuk, hubungan antara dermis dan epidermis menjadi lebih kuat. Data literatur menunjukkan bahwa transplantasi keratinosit alogenik ke luka pada pasien luka bakar merupakan metode yang menjanjikan. Terlepas dari kenyataan bahwa penolakan keratinosit alogenik terjadi, menurut berbagai penulis, dalam 10 hari hingga 3 bulan, mereka tetap memainkan peran mereka dalam penyembuhan permukaan luka, mengeluarkan faktor pertumbuhan dan menutup cacat secara mekanis. Dipercayai bahwa MPALC memiliki aktivitas antigenik yang berkurang, karena selama kultivasi in vitro mereka kehilangan sel Langerhans, yang memungkinkan mereka untuk bertahan lama di tubuh penerima. Selain itu, kultur alogenik yang diperoleh dari kulit orang muda yang sehat memiliki potensi biologis yang jauh lebih besar daripada kultur autologus pasien setelah cedera.

Tujuan utama penelitian kami adalah untuk mengetahui apakah keratinosit alogenik akan tumbuh pada bekas luka dan perubahan apa yang akan terjadi pada jaringan parut di bawah pengaruh "lapisan luka" yang aktif secara biologis tersebut. Jika hasilnya positif, untuk mengembangkan teknologi yang paling efektif dan paling sedikit membutuhkan tenaga kerja untuk bidang pengobatan rehabilitasi ini.

Data yang kami peroleh dalam banyak hal mirip dengan data literatur tentang perubahan morfologi yang terjadi pada epidermis manusia setelah transplantasi keratinosit alogenik ke luka bakar. Namun, ada juga perbedaan yang signifikan, baik dalam hal substrat morfologi tempat transplantasi terjadi maupun dalam hal teknologi. Dengan demikian, proses pembentukan membran dasar dan hubungan dermal-epidermal (hemidesmosom, papila) terjadi pada tahap selanjutnya dibandingkan dengan transplantasi keratinosit ke permukaan luka tanpa perubahan sikatrikial. Tampaknya, hal ini terjadi karena nutrisi jaringan parut yang lebih buruk dibandingkan dengan dermis atau fasia otot. Bekas luka, terutama yang lama, adalah jaringan ikat padat dengan jumlah pembuluh darah yang sangat sedikit, sedangkan bagian bawah luka bakar adalah jaringan granulasi yang kaya akan pembuluh darah. Dengan demikian, jelas bahwa kondisi di mana transplantasi dan pencangkokan keratinosit terjadi sama sekali berbeda. Semakin banyak vaskularisasi area transplantasi sel, semakin mudah proses pencangkokannya. Dari postulat ini mengikuti kesimpulan tentang preferensi bekerja pada bekas luka muda, di mana jaringan ikat masih cukup longgar dan kaya akan pembuluh darah.

Hasil dari kerja percobaan ini terbukti bahwa:

1. Transplantasi MPALK ke bekas luka dimungkinkan.
2. Metode transplantasi yang optimal adalah transplantasi keratinosit pada penutup luka.
3. Permukaan bekas luka harus dipoles menggunakan dermabrasi laser bedah atau pemotong Schumann.
4. Di bawah pengaruh MPALK, epitelisasi cepat pada permukaan bekas luka yang dipoles terjadi.
5. Semakin baik vaskularisasi jaringan parut, yaitu semakin muda parutnya, semakin baik hasil transplantasi keratinosit.
6. Di bawah pengaruh keratinosit yang ditransplantasikan, jaringan parut secara bertahap berubah dan berubah menjadi seperti dermal (jaringan parut yang lebih longgar dengan pelengkap kulit).
7. Pelonggaran jaringan parut secara bertahap, dimulai dengan lapisan subepidermal. Vaskularisasinya membaik, berkas serat kolagen di bagian atas dan bawah bekas luka memiliki susunan yang lebih longgar daripada di jaringan parut tanpa transplantasi sel. Folikel rambut dan kelenjar sebasea muncul. Epidermis, dalam strukturnya, setelah melewati fase hipertrofi, mendekati epidermis kulit normal.
8. Perubahan yang diamati dikaitkan dengan faktor pertumbuhan dan sitokin yang disekresikan oleh keratinosit, yang dengan memperbaiki trofisme jaringan parut, mendorong transformasinya dari jaringan fibrosa kasar menjadi jaringan yang lebih longgar, yang mengarah pada perbaikan tampilan jaringan parut.

Dengan demikian, berdasarkan penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa keratinosit yang ditransplantasikan memiliki efek menguntungkan pada jaringan parut, yang mungkin memiliki implikasi praktis untuk rehabilitasi pasien dengan berbagai jenis bekas luka.

Pekerjaan pada tikus ini juga memungkinkan kami merumuskan persyaratan untuk penutup luka tempat keratinosit tumbuh.

Pembalut luka harus:

• biokompatibel dengan sel,
• bernapas,
• memiliki dasar yang elastis dan dapat membentuk bentuk,
• bersifat hidrofilik,
• sebagai aditif obat mengandung obat antibakteri dan antioksidan yang tidak beracun bagi sel yang dikultur.

Hasil klinis perawatan bekas luka secara bioteknologi.

Sebelumnya, N. Carver dkk. (1993) menemukan bahwa pembalut oklusif paling baik meningkatkan perlekatan pada luka dan kelangsungan hidup keratinosit, tetapi tidak memungkinkan pembentukan epidermis berlapis (matang). Lingkungan udara diperlukan untuk pembentukan epidermis berlapis. Oleh karena itu, setelah perlekatan lapisan berlapis-lapis, diusulkan untuk melepas pembalut luka oklusif setelah 7-10 hari dan mengobati luka dengan pembalut kering atau salep yang larut dalam air. Dapat dikatakan bahwa kualitas dan sifat "substrat" tempat sel tumbuh merupakan poin yang sangat penting untuk efektivitas transplantasi bahan seluler, dan karenanya untuk hasil kerja dokter. Namun, saat ini tidak ada pembalut luka yang ideal, meskipun banyak pilihan yang diusulkan (kulit buatan, kain bukan tenunan yang terbuat dari karboksimetil selulosa, pelapis fibrin, film poliuretan semipermeabel). Poin penting dalam hal ini adalah biaya "substrat" (penutup luka khusus), karena biayanya yang tinggi meningkatkan keseluruhan biaya perawatan bioteknologi.

Keefektifan teknologi sel telah terbukti hingga saat ini, tetapi sayangnya teknologi ini sangat mahal, terutama di negara-negara yang belum memiliki produksi industri komposisi sel. Akan tetapi, negara-negara seperti Amerika Serikat telah lama membangun industri untuk produksi bahan sel untuk transplantasi luka bakar. Secara khusus, perusahaan BioSurface Technology Inc., sejak tahun 1989, telah menumbuhkan 37.000 lapisan keratinosit berlapis-lapis, yang digunakan untuk merawat 240 pasien di 79 negara di seluruh dunia (R. Odessey, 1992), sementara 1 cm 2 kultur ^sel berharga sekitar 7-8 dolar AS.

Teknologi untuk mengobati berbagai penyakit dan masalah kulit memiliki sejumlah perbedaan, tetapi setiap perawatan sel didasarkan pada perolehan bahan sel berkualitas tinggi dan transplantasinya.

Proses ini terdiri dari langkah-langkah berikut:

• mengambil kulit dari korban (atau dari pendonor),
• mengangkut penutup kulit ke pusat bioteknologi,
• isolasi sel lapisan basal dan proliferasinya,
• pertumbuhan lapisan keratinosit multilayer (MLK).
• transplantasi kultur sel.

Masalah utama dalam melakukan perawatan menggunakan transplantasi lembaran keratinosit berlapis-lapis adalah kebutuhan akan sel-sel yang hidup pada semua tahap transplantasi sel. Potongan kulit untuk mengisolasi sel autologus atau alogenik harus setipis mungkin, karena dalam kasus ini lebih mudah dipisahkan menggunakan metode mekanis dan enzimatik dan memperoleh suspensi sel hidup untuk dikultur. Mereka dapat diperoleh dengan memotong dengan dermatom atau menggunakan kulit kelopak mata, kulup, dan permukaan bagian dalam bahu. Mengingat sel-sel sensitif terhadap halogen (klorin, yodium), hidrogen peroksida, mereka tidak dapat digunakan saat memproses kulit selama pengumpulan bahan.

Hasil kuantitatif dan kualitatif sel dari cangkok kulit dan efisiensi pembudidayaannya juga bergantung pada kesehatan dan usia donor. Selain itu, biopsi kulit harus dilakukan secepat mungkin dan dalam kondisi yang sesuai (lingkungan, suhu) ke laboratorium yang tersertifikasi dan terakreditasi untuk tujuan ini.

Untuk penyimpanan dan pengangkutan flap kulit, dapat digunakan medium Eagle atau medium 199 dengan penambahan 10% serum sapi, medium DMEM dengan penambahan 5% serum fetal sapi, dan antibiotik.

Di laboratorium sitologi, biopsi kulit pertama-tama dibagi secara mekanis menjadi potongan-potongan kecil, kemudian potongan-potongan kulit tersebut diproses menggunakan enzim: tripsin, kolagenase, dispase, dan lain-lain.

Di bawah aksi enzim, desmosom dihancurkan dan keratinosit dilepaskan ke dalam medium dalam bentuk sel-sel individu atau agregat yang terdiri dari jumlah sel yang berbeda. Hanya keratinosit basal yang digunakan untuk budidaya, yang tumbuh pada media khusus dalam termostat yang mengandung 5% CO2, dalam cawan Petri atau dalam labu pada t = 37 ° C. Sudah setelah 48 jam, pembentukan koloni keratinosit diamati, yang secara bertahap bergabung untuk berubah menjadi satu lapisan. Setelah menerima jumlah sel yang cukup, suspensi yang dihasilkan disemai ke pembalut luka yang disiapkan untuk tujuan ini dan ditempatkan di cawan Petri. Pertama, satu lapisan dan kemudian lapisan keratinosit multilayer terbentuk dari suspensi. Tahapan proses budidaya keratinosit secara skematis ditunjukkan pada Gambar 12 (33,43,54,65).

Pembentukan lapisan keratinosit berlapis yang cocok untuk transplantasi biasanya memakan waktu 7-10 hari. Terkadang periode ini lebih lama, yang bergantung pada kualitas bahan sumber (usia, kondisi kesehatan donor, ketepatan pengumpulan bahan, kualitas media yang digunakan, dll.). Jika lapisan berlapis tumbuh berlebihan, maka sel-sel dengan fenomena apoptosis yang tidak cocok untuk transplantasi dapat muncul di permukaannya. Cawan petri dengan lapisan keratinosit berlapis (MLK) yang tumbuh di dalamnya pada penutup luka dikirim ke klinik dalam wadah khusus pada suhu minimal +15° C.

Metode Green yang dimodifikasi untuk menumbuhkan MPC

Dalam penelitian kami, kami menggunakan kain kambrik berlapis-lapis sebagai penutup luka, meninggalkan lapisan "Polypor" yang kami gunakan dalam percobaan dengan tikus. Dengan demikian, kami menumbuhkan lapisan keratinosit berlapis-lapis pada kain kambrik yang telah dihilangkan lemaknya dan steril, meskipun kain kambrik juga bukan penutup luka yang optimal.

Studi klinis dilakukan pada relawan sesuai dengan standar etika yang diperlukan: penandatanganan perjanjian dan persetujuan berdasarkan informasi.

1. Kultur keratinosit milik pasien sendiri (autologus) dan yang disimpan (alogenik) digunakan.
2. Keratinosit pasien diperoleh dari sepotong kulit yang dipotong dari bagian dalam lengan atas mereka.
3. Operasi dermabrasi bekas luka dilakukan dengan menggunakan termokauter, cakram putar, dan laser erbium.
4. Kelompok pasien dengan bekas luka normotrofik, hipotrofik, dan hipertrofik diambil.

Proses teknologi untuk penerapan teknologi seluler untuk memperbaiki penampilan bekas luka kulit terdiri dari tahapan berikut:

1. Pemilihan pasien.
2. Penjelasan tentang hakikat perawatan, jangka waktu untuk memperoleh hasil yang diharapkan, penandatanganan kontrak dan persetujuan.
3. Diberikan kepada pasien 2-3 minggu sebelum operasi selmevit 1 tablet 3 kali sehari, zinctheral 1 tablet 3 kali sehari.
4. Mengambil sepotong kulit sepanjang 2,0 cm dan lebar 0,7-1,0 cm dari permukaan dalam bahu, tinggi, hampir di bagian bawah daerah aksila untuk mendapatkan keratinosit autologus.
5. Dalam kasus di mana pasien menolak untuk mengisolasi keratinosit mereka sendiri karena kemungkinan adanya bekas luka linier pada permukaan bagian dalam bahu, bahan seluler diambil dari bank sel (keratinosit alogenik).
6. Keratinosit diisolasi dan ditumbuhkan di laboratorium yang bersertifikat untuk jenis pekerjaan ini.
7. Setelah memperoleh jumlah MPC yang cukup untuk ditransplantasikan ke bekas luka, ditetapkan hari untuk operasi di klinik, di mana bahan dibawa dalam wadah khusus di cawan Petri.
8. Operasi dermabrasi jaringan parut dilakukan, hemostasis, permukaan yang dipoles dicuci dengan larutan garam steril, dikeringkan, setelah itu MPC ditransplantasikan ke atasnya pada "sel bawah" cambric steril. Artinya, sel-sel yang berada di atas MPC ternyata berada di bawah, berdekatan dengan permukaan yang dipoles.
9. Lapisan film steril diaplikasikan di atasnya, yang ditempelkan pada kulit dengan perban elastis atau plester elastis Omnifix. Alih-alih lapisan film, pembalut luka yang mengandung silikon dapat digunakan, misalnya Mepitel, Mepiform, lembaran gel silikon.

Setelah 5-7 hari, lapisan film atau silikon akan dihilangkan. Pada saat ini, semua keratinosit seharusnya sudah merangkak ke bekas luka yang dipoles dan menempel pada permukaannya.

10. Lingkungan lembap yang terbentuk di bawah lapisan film dan silikon secara aktif berkontribusi terhadap hal ini. Kain kambrik yang tersisa pada bekas luka sejak saat ini dapat direndam dengan gel curiosin atau chitosan. Hasilnya, pada hari ke-2 terbentuk kerak padat, yang, demi kenyamanan pasien, sebaiknya diperbaiki dengan plester elastis dan berpori, seperti Omnifix. Kerak yang berpori memungkinkan epidermis yang terbentuk untuk berdiferensiasi dan berubah menjadi epidermis yang matang.

Bergantung pada jenis bekas luka dan kedalaman pengasahan, perban ditolak setelah 8-10 hari. Pada saat ini, epidermis memiliki 30-40% lebih banyak lapisan sel daripada pada kulit normal. Membran dasar tidak terbentuk. Keratinosit dari epidermis yang menebal mengeluarkan banyak molekul aktif biologis ke dalam jaringan parut.

Keberhasilan perawatan bekas luka bioteknologi sangat bergantung pada metode perawatan pada periode pascaoperasi. Kultur sel merupakan jenis penutup luka yang "lembut" dan pada tahap awal setelah transplantasi, IPC dapat dengan mudah terkelupas dari jaringan di bawahnya. Oleh karena itu, pasien disarankan untuk menangani bekas luka dengan hati-hati setelah operasi. Selama 8-9 bulan, jangan menggosok dan rawat dengan air matang dingin secara perlahan untuk menghindari terkoyaknya epidermis tipis yang baru terbentuk, yang tidak memiliki ikatan erat dengan jaringan di bawahnya.

Catatan.

Sebelum operasi dan selama dermabrasi, penggunaan antiseptik dan oksidator terhalogenasi (iodopiron, suliodopiron, iodinol, iodinat, klorheksidin, hidrogen peroksida) diperbolehkan, sebelum transplantasi sel - sangat dikontraindikasikan karena efek sitotoksiknya. Metilen biru dan hijau cemerlang juga beracun bagi sel.

Untuk menghindari infeksi, terutama saat menangani bekas luka hipertrofik, bidang bedah dapat diobati dengan neomisin sulfat, polimiksin, atau gentamisin. Obat-obatan tersebut tidak memiliki efek sitotoksik pada keratinosit.

Sebagai hasil dari perawatan tersebut, efek rangkap tiga tercapai.

1. Meratakan permukaan bekas luka.
2. Pembentukan lapisan epidermis baru dengan ketebalan normal di atasnya.
3. Transformasi jaringan parut menjadi jaringan seperti kulit karena aksi sitokin, faktor pertumbuhan, dan molekul aktif biologis lainnya yang disekresikan oleh sel yang ditransplantasikan dan dirangsang oleh keratinosit, fibroblas, dan makrofag.

Bekas luka menjadi kurang terlihat, lebih elastis, pori-pori dan rambut vellus muncul di dalamnya, dan pigmentasi dapat dipulihkan karena adanya melanosit di IPC.

Namun, semua aspek positif dari bekas luka ini tidak langsung muncul. Terkait hal ini, pasien perlu diperingatkan bahwa proses transformasi jaringan parut menjadi jaringan dermal berlangsung lambat dan hasil optimal dari perawatan tersebut dapat diharapkan paling cepat dalam 10-14 bulan. Segera setelah balutan ditolak, permukaan yang dipoles memiliki polikromi yang jelas, semakin cerah semakin dalam pemolesan dilakukan. Kerusakan kulit paling sedikit terlihat saat memoles bekas luka normotrofik dengan laser erbium. Warna bekas luka dan kulit di sekitarnya pulih dalam waktu 3 hingga 8 minggu. Meskipun telah dilakukan tindakan pencegahan tersebut, terkadang terjadi hiperpigmentasi pascaoperasi, yang dapat hilang dengan sendirinya dalam beberapa bulan.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]