Diagnosis laboratorium tuberkulosis

Tuberkulosis adalah penyakit yang mudah didiagnosis dalam kondisi modern dan prestasi ilmiah. Diagnosis laboratorium tuberkulosis sangat penting bagi metode diagnostik lainnya, kedua hanya untuk metode penelitian sinar-X.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Tes darah klinis

Pada pasien tuberkulosis, perubahan dalam analisis umum darah tidak patognomonik. Dengan TB tuberkulosis yang terbatas dan tidak aktif, eritrositnya bersifat hipokrom dalam jumlah normal. Ketika infiltrat besar atau pneumonia caseous, sedangkan prevalensi limfadenitis caseous, lesi usus tertentu, serta untuk paru besar atau perdarahan pasca operasi dan catatan erythropenia mikrositosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocytosis, dan terutama poikilotsitoz jarang dijumpai, biasanya dengan anemia berat. Jumlah retikulosit pada langkah TBC kompensasi berkisar 0,1-0,6%, dengan subcompensated - 0,6-1,0% dan 1% ditandai dengan retikulosit dekompensasi.

Ketika tuberkulosis dalam beberapa kasus mungkin ada leukositosis moderat (hingga 15 ribu leukosit.), Kurang radiasi, yang terjadi pada 2-7% pasien dengan proses yang terjadi bentuk-bentuk yang terbatas dan mudah dan 12,5% - oleh TB paru destruktif dan progresif .

Pergeseran yang paling sering terjadi terjadi pada formula leukosit. Tandai neutrofilia relatif dan absolut, pergeseran formula leukosit moderat ke kiri sebelum promyelosit. Myelosit sangat jarang terjadi pada kasus tuberkulosis yang tidak rumit. Peningkatan jumlah neutrofil dengan granularitas patologis dalam hemogram pasien tuberkulosis selalu menunjukkan durasi proses: pada pasien dengan tuberkulosis berat, hampir semua neutrofil mengandung granularitas patologis. Ketika wabah tuberkular berhenti, pergeseran nuklir secara relatif cepat mendekati normal. Granularity patologis neutrofil biasanya menetap lebih lama dari perubahan hemogram lainnya.

Kandungan eosinofil dalam darah perifer juga bervariasi tergantung pada fase proses dan keadaan alergi organisme. Jumlah mereka menurun hingga aneosinofilia pada wabah penyakit yang parah dan berlarut-larut dan, sebaliknya, meningkat dengan resorpsi infiltrat dan efusi pleura, serta pada bentuk awal tuberkulosis primer.

Sebagian besar bentuk tuberkulosis primer disertai dengan limfopenia, yang kadang-kadang diamati selama beberapa tahun, bahkan setelah luka-luka akibat perubahan spesifik. Tuberkulosis sekunder dalam fase eksaserbasi, tergantung pada tingkat keparahan prosesnya, dapat disertai dengan jumlah limfosit normal, atau limfopenia.

Di antara tes untuk mengevaluasi proses tuberkulosis, penentuan tingkat sedimentasi eritrosit (ESR), yang penting dalam mengevaluasi jalannya proses tuberkulosis dan mengidentifikasi bentuk aktifnya, menempati tempat khusus. Peningkatan ESR menunjukkan adanya proses patologis (infeksius-inflamasi, purulen, septik, hemoblastosis, lymphogranulomatosis, dan lain-lain) dan berfungsi sebagai indikator keparahannya, namun, indeks ESR normal tidak selalu menunjukkan tidak adanya patologi. Percepatan sedimentasi eritrosit difasilitasi oleh peningkatan kandungan globulin, fibrinogen, kolesterol dalam darah dan penurunan viskositas darah. Melambatnya sedimentasi eritrosit adalah karakteristik untuk keadaan disertai dengan hemokonsentrasi, peningkatan kandungan albumin dan asam empedu.

Hemogram pada pasien dengan perubahan tuberkulosis selama pengobatan. Pergeseran hematologis hilang lebih cepat, semakin berhasil intervensi terapeutik. Namun, orang harus mengingat efek hemopoiesis dari berbagai obat antibakteri. Mereka sering menyebabkan eosinofilia, dalam beberapa kasus - leukositosis, dan leukopenia lebih sering sampai pada agranulositosis dan reaksi limfoid-retikuler. Pengendalian hematologis yang sistematis dan analisis yang benar terhadap data yang diperoleh sangat penting untuk menilai keadaan klinis pasien, dinamika proses dan keefektifan pengobatan yang digunakan.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]

Analisis klinis urin

Dengan tuberkulosis sistem saluran kemih, urinalisis adalah metode diagnostik laboratorium utama. Anda dapat mengamati leukocyturia, eritrosituria, proteinuria, hypoisostenuria, tuberkulosis mycobacterium, bakteriuria nonspesifik.

Leukositosis adalah gejala TB yang paling sering terjadi pada sistem kemih sebelum kemoterapi spesifik dilakukan dan tidak ada hanya pada kasus luar biasa, misalnya dengan obliterasi lengkap dari lumen ureter. Tes Nechiporenko (penentuan jumlah leukosit dalam 1 ml urin) membantu menilai secara lebih obyektif tingkat leukositosis pada nefrotuberkulosis, dan dalam beberapa kasus, dan untuk mengungkapkannya dalam analisis umum urin yang umum. Namun, harus dipertimbangkan bahwa leukositosis dapat terjadi pada pielonefritis akut, kronis, sistitis, uretritis, batu ginjal dan ureter.

Eritrosituria serta leukositosis. Dianggap sebagai salah satu tanda laboratorium tuberkulosis sistem genitourinari yang paling sering. Frekuensi hematuria tergantung pada prevalensi proses, meningkat seiring proses TB yang merusak berkembang di ginjal. Eritrosituria tanpa leukositosis lebih khas untuk tahap awal tuberkulosis ginjal. Hematuria, yang mendominasi leukositosis, merupakan argumen penting yang mendukung tuberkulosis ginjal dalam diferensiasinya dengan pielonefritis nonspesifik.

[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]

Tes darah biokimia

Dengan tuberkulosis, perubahan pada beberapa parameter biokimia sangat bergantung pada fase proses, komplikasi dan berbagai penyakit bersamaan. Pada pasien dengan tuberkulosis paru-paru dan organ lain yang tidak aktif, total protein dan protein fraksi serum darah tidak berubah dan menentukan kandungan normalnya.

Dalam bentuk akut penyakit, serta dengan eksaserbasi dan perkembangan bentuk kronis tuberkulosis, koefisien albumin-globulin menurun.

Penentuan bilirubin langsung dan total, aminotransferase aspartat (ACT), alanine aminotransferase (ALT) dalam serum darah sangat penting dalam menilai keadaan fungsional dan kerusakan hati organik pada tuberkulosis dan komplikasinya. Penentuan dinamik tingkat aminotransferase. Bilirubin dalam pengobatan pasien tuberkulosis, terutama dalam bentuk parah, merupakan komponen wajib pemeriksaan biokimia pasien tuberkulosis dan dilakukan setiap bulan.

Penilaian keadaan fungsional ginjal mencakup penentuan kreatinin serum dan perhitungan laju filtrasi glomerulus sesuai dengan formula Cockcroft-Gault. Perhitungan laju filtrasi glomerulus menggunakan sampel Reberg memberikan hasil yang kurang akurat.

Tujuan utama studi biokimia dinamis pasien tuberkulosis adalah untuk memantau jalannya proses, deteksi efek samping obat-obatan yang tepat waktu dan koreksi yang memadai terhadap gangguan homeostatik yang dihasilkan.

[28], [29], [30]

Penerapan metode biokimia dalam penyelidikan tuberkulosis ekstrapulmoner

Indikator yang paling informatif adalah kandungan asam tuberculostearic dalam cairan biologis, namun definisinya terkait dengan kesulitan teknis (kebutuhan akan kromatografi gas dan spektrometri massa).

Pengukuran prospektif aktivitas adenosine deaminase - enzim, ditentukan dalam cairan: sinovial, perikardial, asites atau tulang belakang. Produsen utama adenosine deaminase adalah limfosit dan monosit. Penentuan aktivitas adenosine deaminase dalam cairan biologis memudahkan diagnosis sinovitis tuberkulosis, tuberkulosis kelenjar getah bening, meningitis tuberkulosis, serositis tuberkulosis.

Beberapa indikator biokimia karena spesifisitasnya ditentukan hanya dalam cairan biologis, dekat dengan fokus lesi. Ukur tingkat indikator sebagai respons terhadap injeksi tuberkulin subkutan atau intradermal (biasanya sebelum dan 48 dan 72 jam setelah itu). Setelah ini, tingkat kenaikan tingkat penanda (dalam%) dihitung berkenaan dengan tingkat awal.

Penentuan optimal dalam urin aktivitas enzim spesifik organ transamnidase, yang kemunculannya dicatat saat ginjal dari berbagai sifat terpengaruh. Studi tentang transamidinase hanya dibenarkan dalam kondisi injeksi tuberkulin subkutan untuk memperburuk proses inflamasi lokal. Tentukan aktivitas transamidin dalam urin awalnya dan 24-72 jam setelah pengenalan tuberkulin 50 TE. Pembesaran fermentasi dalam 2 kali dan lebih memungkinkan pada 82% kasus untuk membedakan tuberkulosis aktif ginjal dari eksaserbasi pielonefritis kronis.

Dengan tuberkulosis organ kelamin wanita, konsentrasi haptoglobin dan dialdehida malon dalam darah ditentukan pada kondisi tes tuberkulin yang provokatif. Tuberkulin yang disuntikkan secara subkutan dalam dosis 50 TE dan 72 jam kemudian melakukan penelitian biokimia kedua. Dalam kasus etiologi tuberkulosis, tingkat kenaikan kadar haptoglobin tidak kurang dari 28%, dan tingkat malondialdehid adalah 39% atau lebih. Penentuan aktivitas adenosin deaminase dalam cairan peritoneal yang diperoleh dari ruang Douglas juga digunakan. Tanda baca diperiksa ulang 72 jam setelah injeksi tuberkulin intradermal pada dosis 0,1 TE dan 0,01 TE ke dalam proyeksi organ genital internal di dinding perut anterior. Untuk mendukung proses tuberkulosis, peningkatan aktivitas adenosine deaminase adalah 10% atau lebih dibandingkan dengan yang pertama.

Bila mata terkena, reaksi fokal yang terjadi di mata sebagai respons terhadap stimulasi antigenik diperiksa. Hal ini tidak diinginkan untuk mengembangkan respons yang diucapkan, disertai dengan penurunan fungsi visual. Karena penilaian reaksi fokal minimal seringkali sulit, untuk objektivitas kesimpulan disarankan untuk mengorientasikan secara paralel dan pada tingkat pertumbuhan serum darah haptoglobin atau adenosine deaminase.

Semua penelitian biokimia harus dilakukan bersamaan dengan metode lainnya.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]

Penelitian sistem koagulasi darah

Relevansi studi keadaan sistem koagulasi darah dalam phthisiology adalah karena adanya hemoptisis ringan atau perdarahan paru pada sejumlah pasien tuberkulosis, serta komplikasi hemocoagulasi dalam perawatan bedah tuberkulosis. Selain itu, aliran laten hemorragulasi intravaskular yang secara alami menyertai tuberkulosis mempengaruhi jalannya penyakit dan efektivitas kemoterapi.

Pada pasien tuberkulosis paru dengan predominan komponen eksudatif peradangan, penurunan aktivitas darah antikoagulan diamati. Pada pasien dengan prevalensi lesi spesifik yang rendah di paru-paru dengan dominasi komponen produktif peradangan, hemokagulasi intravaskular tidak diungkapkan secara signifikan. Pada pasien dengan TB paru dengan hemoptisis dan negara perdarahan sistem pembekuan darah paru berbeda: pada pasien dengan kehilangan darah rendah pada gemoptoe tinggi atau segera setelah penghentian ada peningkatan tajam dalam kemampuan pembekuan darah akibat intensifikasi parah trombinoobrazovaniya tetap menjaga peningkatan "struktural" pembekuan. Pada pasien dengan kehilangan darah masif, penurunan potensial koagulasi diamati karena penurunan konsentrasi fibrinogen. Aktivitas faktor XIII, jumlah trombosit. Pada tahap perawatan bedah, pasien dengan jenis TB terbatas tidak mengalami kelainan ringan yang signifikan dengan sistem homeostasis. Pada pasien dengan proses lanjut dalam kinerja pneumon atau pleuropneumonectomy, sindrom ICD sering berkembang, yang dapat memperoleh bentuk "penyakit kedua".

Untuk memantau keadaan pembekuan darah pada pasien dengan TB paru harus dilakukan penentuan waktu tromboplastin parsial teraktivasi (aPTT), fibrinogen, waktu trombin, indeks protrombin dan waktu perdarahan dan waktu pembekuan.

[38], [39], [40], [41], [42], [43]

Penelitian hormonal

Observasi eksperimental dan klinis modern menunjukkan adanya perubahan status hormon dalam peradangan paru tuberkulosis tertentu. Hal ini membuktikan bahwa koreksi disfungsi dari sistem hipofisis-tiroid hipofisis-adrenal dan fungsi pankreas dalam hubungannya dengan terapi anti-TB berkontribusi aktivasi fibrogenesis dan perbaikan pada peradangan tertentu lokus.

Negara fungsional dari sistem hipofisis-tiroid dinilai oleh konten dalam serum darah triiodothyronine (T ₃ ), tiroksin (T ₄ ), hipofisis thyroid stimulating hormone (TSH). Telah ditetapkan bahwa hipotiroidisme subklinis terdeteksi pada 38-45% pasien dengan tuberkulosis paru, dan paling sering didiagnosis dengan bentuk proses disebarluaskan dan berserat. Di bawah bentuk-bentuk yang sama yang paling dramatis mengurangi tingkat kedua T ₃ dan T ₄, dan ada datang ketidakseimbangan hormon ini dalam bentuk peningkatan rasio T ₄ / T _s.

Fungsi korteks adrenal dinilai dengan kadar kortisol dalam serum darah, dan fungsi inkremental pankreas oleh konsentrasi insulin reaktif kekebalan tubuh. Pada fase akut penyakit menular, kebutuhan akan kortisol endogen dan insulin meningkat. Hiperinsulinemia juga menunjukkan resistensi insulin pada jaringan tubuh, yang khas untuk setiap proses inflamasi aktif, khususnya spesifik. Penentuan fungsi glukokortikoid kelenjar adrenal dengan tuberkulosis paru aktif memungkinkan untuk mengungkapkan adanya hiperkortisme pada sebagian besar pasien. Konsentrasi kortisol darah normal pada pasien dengan peradangan menular pada periode akut harus dianggap sebagai defisiensi relatif fungsi glukokortikoid korteks adrenal, yang dapat menjadi dasar untuk melakukan terapi substitusi dengan dosis glukokortikoid yang adekuat.

Hampir sepertiga pasien tuberkulosis paru dapat menetapkan bahwa tingkat insulinemia di dalamnya cukup rendah dan mendekati batas bawah norma, sementara 13-20% mengamati hiperininsulinisme yang signifikan. Hipotesis insulin dan hiperinsulinisme relatif merupakan faktor risiko tinggi untuk pengembangan pelanggaran metabolisme karbohidrat dalam berbagai tingkat. Perubahan aktivitas fungsional sel B pankreas ini memerlukan pemantauan glikemia secara teratur pada pasien tuberkulosis dan pencegahan diabetes mellitus secara tepat waktu. Selain itu. Ini berfungsi sebagai pembenaran tambahan untuk kemanfaatan penggunaan insulin fisiologis dalam terapi kompleks tuberkulosis.

Secara umum, penurunan kadar hormon tiroid, ketidakseimbangan, hypercortisolemia dan hiperinsulinisme paling besar pada pasien tuberkulosis berat, dengan lesi paru-paru yang luas dan gejala keracunan tuberkulosis yang parah.

Diagnosis mikrobiologis tuberkulosis

Studi mikrobiologi diperlukan untuk mengidentifikasi pasien tuberkulosis, memverifikasi diagnosis, pemantauan dan koreksi kemoterapi, mengevaluasi hasil pengobatan, dengan kata lain, sejak pasien terdaftar dengan tuberkulosis sebelum melepaskannya.

Semua program dan proyek epidemiologi didasarkan pada penilaian jumlah ekskavator bakteri, yang tidak dapat dilakukan tanpa menggunakan metode laboratorium untuk mendeteksi mycobacteria tuberculosis. Dalam sebuah survei terhadap populasi yang tidak terorganisir, persentase penyerbu bakteri mencapai 70 atau lebih, yang membuat metode laboratorium menjadi alat yang cukup efektif untuk mengidentifikasi pasien tuberkulosis di antara kelompok populasi ini.

Metode mikrobiologi tradisional untuk mendiagnosis tuberkulosis adalah studi bakteriologis dan kultur. Metode modern mempertimbangkan budidaya mycobacterium tuberculosis dalam sistem otomatis, setting PCR. Namun, semua metode ini harus dikombinasikan dengan metode bakteriologis klasik.

Koleksi bahan diagnostik

Efektivitas studi laboratorium sangat bergantung pada kualitas bahan diagnostik. Kepatuhan terhadap peraturan untuk pengumpulan, penyimpanan dan pengangkutan bahan diagnostik dan implementasi yang tepat dari algoritma penilaian pasien secara langsung mempengaruhi hasil dan memastikan keamanan hayati.

Untuk pengujian tuberkulosis, berbagai bahan digunakan. Karena tuberkulosis paru adalah bentuk tuberkulosis yang paling umum, bahan utama untuk penelitian ini adalah sputum dan jenis pohon trakeobronkial lainnya untuk dipisahkan: detasemen saluran pernapasan bagian atas diperoleh setelah inhalasi aerosol: pembilasan bronkial; pembedahan bronchoalveolar; bahan yang diperoleh dengan bronchoscopy, transtracheal dan intrapulmonary biopsy: aspirate dari bronchi, laryngeal strokes, exudate, smear dari luka, dll.

Efektivitas penelitian meningkat jika pengumpulan bahan yang terkontrol dari pasien dilakukan. Untuk tujuan ini, sebuah ruangan yang dilengkapi khusus dialokasikan atau taksi khusus dibeli. Pengumpulan bahan adalah prosedur yang berbahaya, oleh karena itu perlu mengumpulkan bahan untuk penelitian, mengamati peraturan keselamatan infeksi.

Bahan untuk pengujian pada mycobacterium tuberculosis dikumpulkan dalam botol steril dengan penutup yang rapat untuk mencegah kontaminasi lingkungan dan melindungi bahan yang terkumpul dari kontaminasi.

Botol untuk koleksi bahan diagnostik harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:

• harus terbuat dari bahan tahan dampak;
• harus mudah meleleh selama autoklaf;
• dari volume yang cukup (40-50 ml):
• memiliki lubang lebar untuk pengumpulan dahak (diameter tidak kurang dari 30 mm);
• mudah ditangani, transparan atau tembus pandang, sehingga Anda bisa menilai kuantitas dan kualitas sampel yang dikumpulkan tanpa membuka tutupnya.

Untuk mendapatkan hasil penelitian yang optimal, kondisi berikut harus diperhatikan:

• Kumpulkan bahan sebelum dimulainya kemoterapi;
• Bahan untuk penelitian harus dikumpulkan sebelum asupan makanan dan obat pagi;
• Untuk penelitian, sangat diharapkan untuk mengumpulkan sekurang-kurangnya 3 sampel dahak pagi. Mengumpulkan dahak selama 3 hari berturut-turut;
• bahan yang dikumpulkan harus dikirim ke laboratorium sesegera mungkin:
• dalam kasus dimana segera tidak mungkin untuk mengirimkan bahan ke laboratorium, disimpan di kulkas pada suhu udara 4 ° C selama tidak lebih dari 48 jam;
• Saat mengangkut material, perlu memonitor integritas botol secara ketat.

Kolaps yang terkumpul dengan benar adalah mucous atau mucopurulen. Volume optimal dahak yang diuji adalah 3-5 ml.

Sputum dikumpulkan di bawah pengawasan seorang profesional medis. Orang yang bertanggung jawab atas pengumpulan dahak harus mengikuti penerapan peraturan tertentu:

• perlu untuk menjelaskan kepada pasien tujuan penelitian dan kebutuhan untuk batuk bukan cairan ludah atau lendir nasofaring, tapi isi saluran pernapasan dalam. Hal ini bisa diraih akibat batuk produktif yang terjadi setelah beberapa (2-3) nafas dalam. Hal ini juga perlu untuk memperingatkan pasien bahwa ia harus membilas mulutnya dengan air matang, untuk menghilangkan bagian utama mikroflora yang tumbuh di rongga mulut dan residu makanan yang menghambat pemeriksaan dahak;
• seorang pekerja medis yang berpartisipasi dalam pengumpulan dahak, selain jubah mandi dan topi, harus mengenakan masker, sarung tangan karet dan celemek karet;
• berdiri di belakang pasien, dia disarankan agar botolnya sedekat mungkin ke bibirnya dan segera memisahkannya dengan dahak saat batuk, dan harus disediakan agar aliran udara diarahkan menjauh dari petugas kesehatan:
• Setelah menyelesaikan pengumpulan dahak, petugas kesehatan harus menutup botol dengan hati-hati dengan hati-hati dan menilai kuantitas dan kualitas dahak yang dikumpulkan. Kemudian botol diberi label dan ditempatkan di bix khusus untuk transportasi ke laboratorium.

Jika pasien tidak menghasilkan dahak, malam sebelumnya dan pagi pada hari pengumpulan bahan yang diperlukan untuk memberinya ekspektoran :. Sebuah ekstrak akar marshmallow (mukaltin), Bromhexine, ambroxol, dll - atau menerapkan inhalasi menjengkelkan menggunakan peralatan yang dipasang di dalam ruangan untuk mengumpulkan dahak Materi yang dikumpulkan dengan cara ini tidak tunduk pada konservasi dan harus diperiksa pada hari pengumpulan. Untuk menghindari "pemusnahan" di laboratorium ke arahnya harus membuat tanda khusus.

Jika studi mikrobiologi tidak dilakukan di fasilitas ini, bahan diagnostik yang dikumpulkan harus dikirim secara terpusat ke laboratorium, asalkan materi tersebut disimpan dalam interval antara persalinan di kulkas atau dengan penggunaan bahan pengawet. Kirimkan bahan ke laboratorium dalam kotak transportasi, yang dapat dengan mudah didesinfeksi. Setiap sampel harus diberi label yang sesuai, dan keseluruhannya harus diisi dengan formulir yang menyertainya.

[44], [45], [46], [47]

Modus dan frekuensi pemeriksaan pasien

Pada pemeriksaan awal, yang disebut diagnostik, pemeriksaan pasien untuk tuberkulosis, perlu untuk memeriksa setidaknya 3 bagian sputum selama 2 atau 3 hari. Dikumpulkan di bawah pengawasan tenaga medis, yang meningkatkan efektivitas mikroskopi.

Skrining primer untuk tuberkulosis harus dilakukan oleh semua institusi diagnostik medis dari sistem perawatan kesehatan. Baru-baru ini, pusat mikroskopi yang disebut, dilengkapi mikroskop modern dan peralatan untuk keselamatan epidemik, telah diselenggarakan berdasarkan laboratorium diagnostik klinis untuk meningkatkan efisiensi pemeriksaan awal.

Di fasilitas anti-TB, tes skrining digunakan yang mencakup pemeriksaan dahak atau bahan diagnostik lainnya minimal 3 kali lipat selama 3 hari. Selama pengobatan, studi mikrobiologi dilakukan secara rutin setidaknya sebulan sekali selama fase kemoterapi intensif. Pada masa transisi ke tahap pengobatan, penelitian dilakukan lebih jarang - dengan selang waktu 2-3 bulan, sedangkan frekuensi penelitian dikurangi menjadi dua.

Fitur pengumpulan bahan diagnostik untuk tuberkulosis ekstrapulmoner

Keunikan bahan patologis dalam bentuk tuberkulosis ekstrapulmoner adalah rendahnya konsentrasi mycobacterium tuberculosis di dalamnya, yang memerlukan metode pemeriksaan mikrobiologi yang lebih sensitif, pertama-tama, metode menabur pada medium nutrisi.

Dengan tuberkulosis sistem genitourinari, urin adalah bahan studi yang paling mudah diakses. Pengambilan urin harus dilakukan oleh perawat yang terlatih secara khusus.

Genitalia eksterior dicuci dengan air dengan sabun atau larutan permanganat kalium yang lemah. Pembukaan luar uretra dirawat dengan hati-hati. Dalam botol steril, porsi rata-rata urin pagi dikumpulkan: pada pria, secara alami, pada wanita, menggunakan kateter. Urin dari pelvis ginjal dikumpulkan dalam tabung steril dengan kateterisasi satu atau dua ginjal, dalam kasus terakhir - harus terpisah dari setiap ginjal. Sejumlah kecil urin ini disentrifugasi, sedimen diperiksa.

Pada pria, sperma, testis tusuk jarum, rahasia prostat mengalami sentrifugasi untuk mendapatkan endapan. Dengan adanya lokalisasi proses spesifik di area genital pada pria, pijat prostat dapat mendorong sekresi sekresi yang mengandung mycobacterium tuberculosis.

Darah haid pada wanita dikumpulkan dengan mengisap atau menggunakan topi Kafka. Bahan yang diperoleh dibebaskan dari sel darah merah, dicuci dengan air suling diikuti dengan sentrifugasi. Endapan diperiksa.

Alokasi dari kanal serviks rahim dikumpulkan dalam beberapa kapasitas atau tutup Kafka, yang diinginkan untuk mengumpulkan 1-2 ml bahan patologis.

Bahan yang diperoleh dari intervensi operasi pada ginjal, alat kelamin. Dengan biopsi, bekas dari endometrium, homogenisasi. Untuk melakukan ini, ia ditempatkan dalam mortar steril dan dilumasi dengan gunting steril. Untuk suspensi yang diperoleh tambahkan pasir sungai steril dalam jumlah yang sama dengan massanya, kemudian tambahkan 0,5-1,0 ml larutan natrium klorida isotonik dan kemudian giling semuanya sampai terbentuknya bubur seperti massa dengan penambahan larutan natrium klorida isotonik (4-5 ml). Kemudian massa diijinkan untuk menetap selama 1-1,5 menit, supernatan diperiksa.

Tuberkulosis tulang dan persendian. Tanda baca (pus of abcesses) yang diperoleh dengan jarum suntik steril ditempatkan di piring steril dan segera dikirim ke laboratorium. Pipet steril, sebelumnya dibasahi dengan larutan natrium klorida isotonik steril, ambil 2-5 ml nanah, transfer ke sebotol manik-manik dan tambahkan 2-3 ml larutan natrium klorida isotonik. Botol ditutup dengan gabus dan dikocok dalam peralatan joker selama 8-10 menit. Suspensi yang dihomogenkan diperiksa.

Dalam bentuk fistulous tuberkulosis osteoartikular, nanah dari fistula diambil. Pelepasan berlebihan dikumpulkan langsung ke tabung reaksi. Dalam kasus eksposur minimal nanah, fistula dicuci dengan larutan natrium klorida isotonik steril, dan air pencuci yang dikumpulkan dalam tabung reaksi atau sepotong tampon yang diimpregnasi dengan nanah dikirim ke penelitian ini.

Bahan bedah yang diperoleh selama intervensi bedah pada tulang dan sendi dapat terdiri dari massa nekrotik purulen, granulasi, jaringan parut, jaringan tulang, jaringan membran sinovial dan substrat lainnya. Pengobatannya dilakukan, seperti pada tuberkulosis ginjal.

Pemeriksaan mikrobiologi cairan sinovial dalam larutan natrium sitrat 3% (rasio 1: 1) untuk mencegah koagulasi dilakukan segera setelah tusukan.

Tuberkulosis dari kelenjar getah bening. Darah, yang diekstraksi selama tusukan kelenjar getah bening, juga diperiksa. Sebagai pus dari abses. Jaringan kelenjar getah bening yang diperoleh selama intervensi bedah, biopsi, diperiksa, seperti pada bentuk tuberkulosis lainnya.

Studi tentang massa tinja pada mycobacterium tuberculosis sangat jarang terjadi, karena hampir tidak ada hasil positif.

[48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Mikroskop Mycobacterium

Mikroskop sputum adalah metode yang relatif cepat, sederhana dan murah yang harus digunakan pada semua kasus dengan dugaan tuberkulosis. Selain itu, penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi efektivitas kemoterapi dan untuk memastikan pemulihan atau kegagalan pengobatan jika tidak ada uji kultur.

Dua metode pemeriksaan mikroskopik digunakan:

• metode mikroskop langsung, bila smear disiapkan langsung dari bahan diagnostik;
• metode mikroskopi sedimen yang dibuat dari bahan yang diberi perlakuan dekontaminif untuk kultur.

Metode pertama digunakan di laboratorium yang hanya dilakukan studi mikroskopis (laboratorium klinis dan diagnostik dari jaringan medis umum).

Hasil terbaik pemeriksaan mikroskopik diperoleh dengan memusatkan bahan diagnostik (misalnya dengan sentrifugasi).

Untuk mendeteksi mycobacterium tuberculosis dengan probabilitas 50% saat melakukan mikroskopi, 1 ml dahak harus mengandung lebih dari 5000 sel mikroba. Sputum pasien dengan bentuk paru tuberkulosis biasanya mengandung sejumlah bakteri asam cepat, yang memungkinkan mereka terdeteksi secara andal dengan bakterioskopi. Sensitivitas diagnostik metode ini dapat meningkat jika beberapa sampel dahak diperiksa dari satu pasien. Hasil negatif dari pemeriksaan bakteriologis tidak mengecualikan diagnosis tuberkulosis, karena dahak beberapa pasien mengandung lebih sedikit mikobakteri daripada yang dapat dideteksi dengan mikroskopi. Sediaan apung sputum yang buruk juga dapat menyebabkan hasil negatif dari pemeriksaan bakteriologis.

Metode yang paling umum untuk mendeteksi mikobakteri asam-cepat di dalam smear adalah warna menurut Tsiol-Nelsen. Metode ini didasarkan pada penetrasi fuchsin karbol ke dalam sel mikroba melalui membran yang mencakup lapisan lipida-lilin, sekaligus pemanasan dan aksi etsa fenol yang kuat. Perubahan warna pada apusan dengan larutan 25% asam sulfat atau asam hidroklorida 3% menyebabkan perubahan warna pada semua struktur yang tidak cepat asam. Unsur-unsur noda dari noda tersebut diwarnai dengan larutan biru metilen 0,3%. Mycobacteria tidak merasakan pewarna anilin biasa, akibatnya mikobakteri asam-cepat berwarna merah tua, dan mikroba dan unsur seluler lainnya - berwarna biru.

Untuk mempelajari noda yang diwarnai oleh Tsilyu-Nelsen, gunakan mikroskop binokular terang dengan tujuan perendaman (pembesaran 90 atau 100 kali lipat) dan lensa mata dengan pembesaran 7- atau 10 kali lipat. Jelajahi 100 bidang penglihatan, yang cukup untuk mengidentifikasi mikobakteri tunggal di dalam smear. Jika hasil penelitian semacam itu negatif, untuk konfirmasi disarankan untuk melihat 200 bidang penglihatan lainnya. Catat hasilnya, menunjukkan jumlah asam basa cepat yang terdeteksi (KUM).

Selain teknik ini, fluorochrom warna digunakan untuk mikroskop luminescent, yang memungkinkan pencapaian hasil terbaik. Penggunaan metode ini meningkatkan efisiensi mikroskop sebesar 10-15%. Saat merawat mikobakteri dengan pewarna luminescent (auramine, rhodamine, dll.), Zat ini juga mengikat struktur mirip lilin dari sel mikroba. Ketika menyinari sel-sel berwarna dengan sumber cahaya yang menarik (spektrum radiasi ultraviolet tertentu), mereka mulai bersinar dengan cahaya oranye atau merah terang pada latar belakang hijau hitam atau gelap. Karena kecerahan dan kontras yang tinggi dari gambar yang terlihat, pembesaran keseluruhan mikroskop dapat dikurangi 4-10 kali, bidang pandang melebar dan waktu persiapan berkurang. Seiring dengan ini, karena kedalaman lapangan yang jauh lebih besar, Anda dapat meningkatkan kenyamanan belajar.

Ketika mikroskop fluoresensi digunakan untuk memindai area yang sama, smear menghabiskan waktu secara signifikan lebih sedikit daripada mikroskop cahaya pewarnaan Tsiol-Nelsen. Jika untuk hari kerja mikroskop memeriksa sekitar 20-25 smear tersebut, maka dengan bantuan mikroskop fluoresensi, dia dapat memeriksa lebih dari 60-80 sampel pada saat bersamaan. Ahli mikroskop berpengalaman mengetahui bahwa pewarnaan sel dengan campuran auramine dan rhodamine agak berbeda dengan bacilli asam-cepat, yang dalam hal ini terlihat seperti batang emas. Saprophytes dicat dengan warna kehijauan.

Keuntungan penting lain dari metode mikroskop fluoresen - kemampuan untuk mendeteksi mycobacterium diubah, hilang di bawah pengaruh faktor yang merugikan, termasuk kemoterapi intensif, properti kislotousotoychivosti dan tidak terdeteksi sehubungan dengan pewarnaan ini Ziehl-Nelsenu.

Kelemahan metode mikroskop fluoresensi meliputi biaya mikroskop dan operasinya yang relatif tinggi. Namun, di laboratorium terpusat atau laboratorium besar lainnya dimana muatannya melebihi norma 3 teknisi laboratorium yang bekerja dengan tiga mikroskop konvensional, lebih murah menggunakan satu mikroskop fluoresensi.

Metode Bacterioscopic memiliki spesifisitas yang cukup tinggi (89-100%). Sekitar 97% dari hasil positif yang diperoleh dengan metode mikroskopi jelas dikonfirmasikan oleh hasil penaburan.

Perlu dicatat bahwa ketika pemeriksaan mikroskopis terhadap bahan bahan patologis, tidak mungkin untuk menentukan spesies yang termasuk dalam mikotrofi cepat asam yang teridentifikasi. Metode mikroskopi memungkinkan untuk memberikan kesimpulan hanya tentang adanya atau tidak adanya mikroorganisme cepat asam dalam sediaan, yang dijelaskan oleh adanya sejumlah mikroorganisme resisten tuberkulosis yang secara morfologis mirip dengan mikobakteri.

Hasil mikroskop dievaluasi pada unit semiquantitatif.

Agar dapat membandingkan hasil metode mikroskopi yang berbeda, koefisien empiris diperkenalkan. Misalnya, untuk membandingkan hasil pap diwarnai dengan pewarna fluorescent, lampu data penelitian mikroskop (1000 kali perbesaran), perlu untuk membagi jumlah basil tahan asam terdeteksi oleh mikroskop fluoresensi, yang sesuai koefisien pada perbesaran 250 kali lipat - untuk 10, 450 kali lipat - ke 4, dengan 630 kali lipat - ke 2.

Fitur mikroskopi untuk tuberkulosis ekstrapulmoner

Mikroskop langsung dilakukan, serta mikroskop dari noda yang disiapkan setelah pengayaan, diikuti pewarnaan Tsiol-Nelsen atau pewarna luminescent. Mikroskopi langsung dari noda tidak efektif karena konsentrasi mikobakteri yang rendah dalam material, dan oleh karena itu lebih rasional untuk menggunakan metode pengayaan. Yang paling efektif adalah sentrifugasi. Jika bahan biologisnya kental, sentrifugasi digunakan dengan homogenisasi serentak dan pencairan material, yang dilakukan dengan menggunakan sentrifugal berkecepatan tinggi dengan gaya sentrifugasi 3000 g dan larutan hipoklorit. Metode pengayaan lainnya, seperti flotasi mikro, saat ini tidak digunakan karena pembentukan aerosol berbahaya secara biologis.

[58], [59], [60], [61], [62]

Metode budaya diagnosis tuberkulosis

Metode penaburan, atau metode kultur, lebih sensitif daripada mikroskopi smear, dan memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan yang terakhir. Hal ini memungkinkan untuk mendeteksi beberapa lusin mikobakteri yang layak dalam materi yang diteliti dan memiliki nilai diagnostik yang hebat. Hal ini sangat penting saat memeriksa materi dari pasien yang baru didiagnosis atau diobati yang melepaskan sejumlah kecil mikobakteri.

Dibandingkan dengan mikroskopi, penelitian budaya memungkinkan peningkatan jumlah pasien TB yang didiagnosis lebih dari 15-25%, serta memverifikasi tuberkulosis pada tahap awal, bila penyakit ini masih dapat diobati dengan pengobatan. Keuntungan yang sangat penting dari uji kultur adalah kemungkinan memperoleh kultur exciter yang dapat diidentifikasi dan dipelajari sehubungan dengan sensitivitas obat, virulensi dan sifat biologis lainnya.

Kelemahan metode penanaman meliputi durasinya (waktu tunggu bahan mencapai 10 minggu). Biaya yang lebih tinggi, kompleksitas pengolahan bahan diagnostik.

Prinsip penanganan pengobatan bahan diagnostik

Metode mikrobiologi konvensional tidak dapat digunakan dalam melakukan penelitian tuberkulosis. Hal ini disebabkan fakta. Bahwa mycobacterium tuberculosis tumbuh sangat lambat, dan sebagian besar sampel klinis mengandung mikroorganisme pyogenic dan putrefactive yang tumbuh cepat, jamur. Pertumbuhan pesat mereka pada media nutrisi yang kaya mengganggu perkembangan mikobakteri dan tidak memungkinkan mengisolasi agen penyebab tuberkulosis, jadi bahan diagnostik harus diolah sebelum pembibitan. Selain itu, mycobacteria yang dilepaskan dari saluran napas pasien biasanya dikelilingi oleh sejumlah besar lendir, membuat mereka sulit berkonsentrasi. Dalam hal ini, sebelum menanam sputum dan bahan sejenis lainnya, pencairannya, dekontaminasi diperlukan.

Semua deterjen dan dekontamin memiliki efek toksik yang lebih atau kurang diucapkan pada mikobakteri. Sebagai hasil pengolahan, sampai 90% mikobakteri bisa mati. Untuk mempertahankan populasi mikobakteri yang cukup, perlu menggunakan metode pengolahan yang lembut yang, di satu sisi, dapat menekan mikroorganisme pyogenic dan putrefactive yang tumbuh cepat, dan di sisi lain, memaksimalkan kelangsungan hidup mikobakteri yang ada dalam materi.

Tergantung pada bahan, derajat homogenitas dan polusi untuk pre-processing menggunakan berbagai dekontaminan: dahak - 4% larutan natrium hidroksida, solusi trohzameschonnogo natrium fosfat 10%, benzalkonium klorida, trisodium fosfat, NALC-NaOH (N-asetil-L-sistein natrium hidroksida) dengan konsentrasi NaOH akhir 1%, untuk air kencing dan bahan cair lainnya - larutan asam sulfat 3%, untuk sampel yang terkontaminasi, bahan yang mengandung lemak - larutan asam oksalat hingga 5%. Selain itu, dalam beberapa kasus, enzim, surfaktan (deterjen) digunakan. Penggunaan Tween dan beberapa deterjen lainnya disertai oleh kematian sel mikobakteri yang lebih kecil (40-50% bertahan). Namun, mereka hanya bisa digunakan untuk bahan cair. Distribusi terbesar di dunia adalah NALC-NaOH. Diproduksi dalam set. Metode ini memungkinkan untuk mengalokasikan lebih dari 85% populasi sel mycobacterial. Dekontaminasi bahan padat yang mengandung kain lebih sulit, karena sulit untuk menebak tingkat dispersi material selama proses homogenisasi. Misalnya, pengobatan biopsi kelenjar getah bening sering disertai dengan meningkatnya frekuensi kontaminasi oleh flora asing. Dalam kasus ini, 1% etonium dapat digunakan.

Bahan non-homogen dihomogenisasi dengan manik-manik kaca dengan adanya dekontaminator. Bahan cairan pra-disentrifugasi dan hanya endapan yang diobati.

Menabur dan teknik inkubasi

Setelah pretreatment, bahan disentrifugasi, sehingga memicu mikobakteri dan meningkatkan kandungannya dalam sedimen ("pengayaan lumpur"). Endapan yang dihasilkan dinetralisir dan diinokulasi (diinokulasi) dengan media atau tabung nutrisi padat dengan media cair (semiliquid). Dari sisa sedimen, apusan disiapkan untuk pemeriksaan mikroskopis. Teknik pembibitan harus mencegah kontaminasi silang bahan diagnostik.

Untuk interpretasi klinis hasil studi mikrobiologis yang andal, peraturan berikut harus diperhatikan: studi mikroskopis dan kultur harus dilakukan sejajar dari sampel bahan diagnostik yang sama.

Tabung yang diinokulasi ditempatkan dalam termostat pada ^suhu 37 ^° C selama 2 hari dalam posisi horizontal. Ini memastikan penyerapan bahan lebih ke media kultur. Setelah 2 hari, tabung dipindahkan ke posisi vertikal dan ditutup rapat dengan sumbat karet atau silikon untuk mencegah pengeringan media yang ditaburkan.

Tanaman diinkubasi pada 37 ^tentang C selama 10-12 minggu dengan melihat rutin mingguan. Untuk setiap pratinjau, parameter berikut dicatat:

• periode visual diamati dari hari menabur pertumbuhan;
• tingkat pertumbuhan (jumlah CFU);
• kontaminasi tanaman oleh flora mikroba atau jamur asing (tabung tersebut dilepas);
• kurangnya pertumbuhan yang terlihat Tabung dibiarkan di termostat sampai tampilan berikutnya.

Media hara

Berbagai media nutrisi digunakan untuk budidaya mikobakteri; padat, semi cair, cair. Namun, tidak ada media nutrisi yang diketahui memiliki sifat yang menjamin pertumbuhan semua sel mikobakteri. Sehubungan dengan ini, 2-3 media nutrisi dengan komposisi berbeda direkomendasikan untuk digunakan bersamaan untuk meningkatkan efektivitasnya.

WHO merekomendasikan lingkungan Levenstein-Jensen sebagai media standar untuk isolasi utama agen penyebab tuberkulosis dan untuk menentukan sensitivitas obatnya. Ini adalah lingkungan telur yang padat dimana pertumbuhan mikobakteri diperoleh pada hari ke-20-25 setelah menaburkan bahan positif bakteri positif. Tanaman bakteriologis secara negatif memerlukan waktu inkubasi yang lebih lama (sampai 10-12 minggu).

Di negara kita, usulan E.R. Finn lingkungan telur Finn-II. Ini berbeda dalam hal, alih-alih L-asparagin, ia menggunakan sodium glutamat, yang memicu cara lain untuk mensintesis asam amino mikobakteri. Pertumbuhan muncul pada media ini agak lebih awal, dan frekuensi alokasi mikobakteri adalah 6-8% lebih tinggi daripada medium Lowenstein-Jensen.

Untuk meningkatkan efektivitas diagnosis bakteriologis tuberkulosis ekstrapulmoner, disarankan untuk memasukkan media Finn-II yang dimodifikasi ke dalam kompleks media nutrisi. Untuk mempercepat pertumbuhan, natrium thioglycolate 0,05%, yang mengurangi konsentrasi oksigen, ditambahkan ke medium nutrisi Finn-II. Untuk melindungi sistem enzim mikobakteri dari produk toksik peroksidasi lipid dalam medium nutrisi Finn-II, antioksidan α-tocopherol asetat ditambahkan pada konsentrasi 0,001 μg / ml. Pembibitan bahan diagnostik dilakukan sesuai prosedur standar.

Di laboratorium anti-tuberkulosis Rusia, modifikasi lain dari media nutrisi padat digunakan; diusulkan G.G. Media nutrisi Mordovian "Baru", dikembangkan oleh V.A. Media nutrisi anikik A-6 dan A-9, dll.

Karena kerusakan pada berbagai sistem metabolisme sel mikrobial selama kemoterapi, sebagian populasi mikobakteri kehilangan kemampuannya untuk berkembang secara normal pada media nutrisi normal dan memerlukan media nutrisi osmotik (semi cair atau cair).

Penilaian dan pencatatan hasil pembenihan bahan diagnostik

Beberapa strain dan spesies mikobakteri tumbuh perlahan, pertumbuhan bisa muncul bahkan pada hari ke-90. Jumlah tanaman seperti itu kecil, tapi ini memungkinkan tanaman bertahan dalam termostat selama 2,5-3 bulan.

Biakan mycobacterium tuberkulosis yang tidak menentu biasanya tumbuh di lingkungan telur padat dalam bentuk koloni bentuk R dari berbagai ukuran dan spesies. Koloni kering, berkerut, gading, sedikit berpigmen. Di media lain, koloni mycobacterium tuberculosis mungkin lebih lembab. Setelah menjalani kemoterapi atau selama perawatan, koloni yang halus dengan pertumbuhan yang lembab (bentuk S) dapat dialokasikan.

Saat mengisolasi tanaman, satu set penelitian khusus digunakan untuk membedakan tuberkulosis mycobacterium dari mikobakteri non-tuberkulosis dan saprophytes asam-resisten.

Respon positif diberikan setelah pemeriksaan mikroskopis wajib terhadap BTA Tsiol-Nelsen yang diwarnai dari koloni yang tumbuh. Dalam kasus pertumbuhan mikobakteri di aplikasikan, stik merah terang ditemukan yang berbohong secara tunggal atau dalam kelompok membentuk kelompok dalam bentuk felt atau jalinan. Pada kultur muda, terutama yang diisolasi dari obat kemoterapi jangka panjang, mikobakteri dibedakan dengan polimorfisme yang diucapkan, dengan adanya varian pendek, hampir coccoid, atau memanjang yang menyerupai jamur miselia bersama dengan bentuk seperti batang.

Tingkat pertumbuhan mikobakteri ditunjukkan dengan skema berikut: (+) - 1-20 cfu in vitro (eksplan bakteri jarang); (++) - 20-100 CFU in vitro (ekskresi bakteri moderat); (+++) -> 100 CFU in vitro (ekskresi bakteri berlimpah). Dalam diagnosis laboratorium tuberkulosis, tidak cukup untuk menjawab apakah mikobakteri terdeteksi oleh satu atau metode lain. Memiliki pemahaman rinci tentang luas dan sifat populasi mikobakteri, komposisi dan sifatnya. Data inilah yang memungkinkan kita menafsirkan keadaan proses dengan benar, merencanakan taktik dan tepat waktu memperbaiki pengobatan.

Dalam beberapa tahun terakhir, untuk mempercepat pertumbuhan mikobakteri, media nutrisi pada basis agar dengan berbagai aditif pertumbuhan dan penggunaan campuran gas khusus telah diajukan. Untuk mendapatkan pertumbuhan mikobakteri pada media ini, selama kultivasi, atmosfir dengan kandungan karbondioksida tinggi (4-7%) tercipta. Khusus CO _2- inkubator digunakan untuk tujuan ini . Namun, sistem otomatis yang paling maju untuk budidaya mikobakteri: MGIT-BACTEC-960 dan MB / Bact.

Salah satu sistem tersebut adalah sistem MGIT (tabung pertumbuhan mikobakteri yang menunjukkan), yang termasuk dalam pengembangan teknologi tinggi dan ditujukan untuk diagnosis bakteri TB yang dipercepat dan menentukan sensitivitas mikobakteri terhadap obat lini pertama dan obat lini kedua tertentu. MGIT difokuskan untuk menggunakannya sebagai bagian dari perangkat VASTES-960. Mikroorganisme dibudidayakan di tabung khusus dengan media nutrisi cair berdasarkan media Middlebrook-7H9 yang dimodifikasi. Untuk merangsang pertumbuhan mikobakteri dan menekan pertumbuhan mikroflora asing, Suplemen Pertumbuhan MGIT dan campuran obat antibodi PANTA digunakan.

Pertumbuhan mikroorganisme dicatat secara optik. Hal ini didasarkan pada fluoresensi, yang terjadi ketika oksigen dikonsumsi oleh mikobakteri selama pertumbuhan. Pewarna fluorochromic yang bergantung oksigen ditemukan di dasar tabung uji khusus dan ditutup dengan lapisan silikon. Reproduksi mikobakteri menyebabkan penurunan jumlah oksigen dalam tabung dan mengurangi konsentrasi yang menyebabkan peningkatan fluoresensi, yang menjadi terlihat di bawah iradiasi oleh tabung sinar ultraviolet dan photosensor otomatis terdaftar built-in alat VASTES-960. Intensitas pendaran dicatat dalam satuan pertumbuhan (unit pertumbuhan GU). Data pertumbuhan dicatat di komputer, dimana bisa disimpan secara otomatis. Analisis komputer kurva pertumbuhan dapat memberikan informasi tentang adanya berbagai kolam mikobakteri, termasuk non-tuberkulosis, dan juga membantu menilai sifat pertumbuhan mikobakteri.

Sebagai hasil dari pengenalan sistem tersebut, waktu untuk pertumbuhan mikobakteri menurun secara signifikan, rata-rata 11 hari pada VASTES-960 dan 19 hari pada MB / Bact versus 33 hari pada medium nutrisi padat standar. Perlu dicatat bahwa sistem ini memerlukan personil yang berkualifikasi tinggi. Penaburan bahan pada media cair harus disertai dengan menabur media Levenstein-Jensen, yang berperan sebagai duplikator dalam kasus-kasus ketika mycobacterium tuberculosis tidak menimbulkan peningkatan pada media lain.

[63], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71]

Penentuan sensitivitas obat mikobakteri

Penentuan spektrum dan tingkat kepekaan mikobakteri terhadap obat antituberkulosis sangat penting secara klinis, juga untuk evaluasi epidemiologis penyebaran TB dengan resistansi obat. Selain itu, pemantauan resistansi obat memungkinkan untuk menilai keefektifan program TB secara keseluruhan, sebagai indikator integral dari kinerja semua komponen kegiatan anti-tuberkulosis.

Multiplisitas dan waktu sensitivitas obat:

• Sebelum dimulainya pengobatan sekali untuk menentukan strategi dan taktik pengobatan:
• bila diisolasi dari kultur penyakit dari berbagai bahan (sputum, cairan BAL, urine, eksudat, minuman keras, dll), semua strain yang terisolasi diperiksa:
• pada akhir fase intensif pengobatan dengan tidak adanya dinamika klinis dan radiologis:
• jika perlu untuk mengubah rejimen pengobatan dalam kasus berikut:
  • tidak adanya sputum;
  • Mengisolasi kembali kultur setelah dahak-negatif;
  • peningkatan drastis jumlah CMB dalam usapan setelah penurunan awal. Telah diketahui dengan baik bahwa strain mycobacterium tuberculosis, yang heterogen dalam hal sensitivitas obat, diisolasi dari bahan dari pasien dengan tuberkulosis. Sensitivitas strain terhadap obat anti tuberkulosis mungkin berbeda dalam spektrum obat, derajat, frekuensi dan laju terjadinya resistensi.

Tingkat resistensi obat mycobacterium tuberculosis ditentukan sesuai dengan kriteria yang ditetapkan yang berorientasi pada ketahanan klinis dan tergantung pada aktivitas antituberkulosis obat, farmakokinetiknya, konsentrasi pada fokus lesi. Dosis terapeutik maksimum dan sebagainya.

Penentuan sensitivitas obat mycobacteria saat ini dilakukan dengan metode mikrobiologis:

• Konsentrasi absolut (metode pengenceran pada media nutrisi padat atau cair),
• proporsi,
• koefisien resistensi.

Biasanya, resistensi diwujudkan dalam bentuk pertumbuhan koloni mycobacterium tuberculosis yang diamati secara visual, namun ada beberapa metode yang mendorong pertumbuhan pada tahap awal pembelahan sel mycobacteria dalam bentuk reaksi warna. Metode ini memperpendek waktu tes 3-4 sampai 2 minggu.

Sebagai standar di Rusia, metode konsentrasi absolut yang direkomendasikan oleh Komite Kemoterapi WHO telah tersebar luas, yang paling sederhana dari sudut pandang metodologis, namun memerlukan standarisasi dan keakuratan prosedur laboratorium yang tinggi. Uji kepekaan obat terdiri dari satu set tabung reaksi dengan media nutrisi yang dimodifikasi dengan obat anti-TB. Kit terdiri dari 2-3 tabung dengan konsentrasi yang berbeda dari masing-masing obat yang digunakan, satu tabung kontrol dengan media tanpa preparasi dan satu tabung yang mengandung natrium asam salisilat 1000 μg / ml atau asam paranitrobenzoat 500 μg / ml untuk mendeteksi pertumbuhan mikobakteri nontuberkulosis.

Untuk menyiapkan satu set media dengan sediaan, media Levenstein-Jensen yang dimodifikasi (tanpa pati) digunakan, yang dituangkan ke dalam labu. Di masing-masing labu, volume tertentu dari pengenceran preparat antituberkulosis yang tepat ditambahkan. Isi labu dicampur secara menyeluruh, dituang ke dalam tabung dan dilipat dalam posisi miring selama 40 menit pada suhu 85 ° C. Dianjurkan untuk mengumpan medium dalam rewinder listrik dengan kontrol suhu otomatis. Rabu dengan obat anti-TB

Seri 1-st dapat disimpan di kulkas pada suhu 2-4 ° C selama 1 bulan, dengan persiapan baris kedua - tidak lebih dari 2 minggu. Penyimpanan media dengan sediaan pada suhu kamar tidak dapat diterima. Saat menyiapkan solusi obat anti-tuberkulosis, aktivitas mereka diperhitungkan, menghitung konsentrasi, mengoreksi berat molekul bagian nonspesifik dari persiapan, kemurnian, dll. Untuk mengetahui sensitivitas obat, hanya zat kimia murni yang digunakan.

Prinsip metode ini adalah untuk mengetahui konsentrasi obat antituberkulosis yang menghambat pertumbuhan sebagian besar populasi mikobakteri. Jika dilakukan dengan benar, metode ini memiliki reliabilitas yang baik.

Sebelum tes, perlu untuk memastikan bahwa kultur mycobacterium tuberculosis yang diisolasi tidak memiliki mikroflora yang tidak relevan. Dari budaya mycobacteria di 0,9% larutan natrium klorida disiapkan suspensi homogen yang mengandung 500 juta mayat mikroba dalam 1 ml (kekeruhan optik standar 5 unit). Bubur yang dihasilkan diencerkan dengan larutan natrium klorida 0,9% (1:10) dan 0,2 ml slurry ditambahkan ke setiap tabung dari set media kultur. Tabung yang diinokulasi ditempatkan dalam inkubator pada suhu 37 ° C dan diadakan di posisi horizontal selama 2-3 hari ke permukaan miring dari media itu secara merata diinokulasi dengan suspensi dari Mycobacterium tuberculosis. Tabung kemudian dipindahkan ke posisi vertikal dan diinkubasi selama 3-4 minggu. Hasilnya direkam setelah 3-4 minggu.

Karena waktu ekskresi ekskretoris dari bahan klinis pada media nutrisi paling sedikit 1-1,5 bulan, hasil penentuan sensitivitas obat dengan metode ini dapat diperoleh paling cepat 2-2,5 bulan setelah penaburan bahan. Ini adalah salah satu kelemahan utama metode ini.

Menafsirkan hasil penentuan sensitivitas obat mikobakteri berdasarkan kriteria tertentu. Pada media padat, kultur dianggap sensitif terhadap konsentrasi obat yang terkandung di dalam medium jika jumlah koloni mikobakteri yang tumbuh di tabung ini dengan obat tidak melebihi 20, dengan pertumbuhan melimpah di tabung kontrol tanpa obat-obatan. Hanya dengan adanya lebih dari 20 koloni, budaya dianggap tahan terhadap konsentrasi ini. Dalam prakteknya, saat mendapatkan hasil pertumbuhan di tabung uji mendekati 20 cfu. Perlu untuk memberi tahu unit klinis bahwa sensitivitas atau resistensi dalam kasus ini adalah batas, karena kadang-kadang dapat menjelaskan dinamika indikator klinis fuzzy.

Untuk berbagai obat konsentrasi tertentu terbentuk, dimana reproduksi proporsi kritis populasi mikobakteri diamati. Konsentrasi ini disebut "kritis". Sebagai kriteria stabilitas, pertumbuhan populasi mikobakteri pada media nutrisi dengan persiapan pada konsentrasi kritis digunakan.

Dalam praktek TB dalam negeri, dalam menentukan resistansi obat, obat ini tidak terbatas hanya untuk menentukan konsentrasi kritis. Hal ini disebabkan fakta. Bahwa definisi perluasan tingkat resistensi obat patogen memungkinkan klinisi untuk lebih tepat merumuskan taktik kemoterapi, menggunakan pengetahuan tentang efek potentiating kombinasi obat, untuk mengantisipasi resistensi silang atau untuk menggunakan obat yang lebih efektif dari kelompok obat anti-tuberkulosis yang digunakan.

Metode konsentrasi absolut adalah yang paling sederhana, tapi juga yang paling peka terhadap kesalahan yang dibuat saat dilakukan. Lebih dapat diandalkan, terutama dalam menentukan kepekaan terhadap obat lini kedua, dan umum di luar Rusia adalah metode proporsi. Ini memperhitungkan kekurangan metode konsentrasi absolut, namun dalam eksekusi itu lebih sulit dilakukan.

Metode ini sangat mirip dengan metode konsentrasi absolut. Persiapan tabung reaksi dengan obat dilakukan dengan cara yang sama. Seperti pada metode konsentrasi absolut. Namun, dosis benih suspensi mycobacterium tuberculosis berkurang dengan faktor 10. Yang menghilangkan frekuensi resistensi spontan beberapa strain mycobacterium tuberculosis terhadap obat-obatan seperti Etambutol, protionamide, capreomycin. Sebagai kontrol, 2 atau 3 tabung dengan dosis benih sama dengan tabung reaksi, berturut-turut diencerkan 10 dan 100 kali, digunakan. Kriteria stabilitas adalah proporsi pertumbuhan TB mycobacterium yang diamati secara visual. Untuk obat seri 1, kriteria stabilitas adalah kelebihan pertumbuhan 1% dari populasi awal, untuk obat-obatan dari baris kedua - meningkat 1 atau lebih dari 10% dari awal, tergantung pada konsentrasi kritis yang dipilih.

Pada tahun 1997, sebuah kelompok kerja WHO dan International Tuberculosis Union mengenai deteksi resistensi obat anti-TB membuat penyesuaian terhadap kriteria ini, menunjukkan bahwa mikobakteri yang tumbuh pada media telur Levenshtein-Jensen yang padat stabil pada konsentrasi berikut:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampisin 40 μg / ml:
• Etambutol - 2 μg / ml.

Pada tahun 2001, konsentrasi kritis diajukan untuk obat lini kedua berikut (untuk proporsi kritis 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamida - 40 mcg / ml;
• kanamisin - 30 μg / ml;
• viomisin - 30 mcg / ml;
• sikloserin 40 μg / ml;
• asam aminosalisilat - 0,5 μg / ml;
• ofloksasin - 2 μg / ml

Hasil pertumbuhan dievaluasi setelah 4 minggu sebagai awal dan setelah 6 minggu berkultivasi - sebagai yang terakhir.

Untuk mengetahui sensitivitas obat terhadap pirazinamida, yang banyak digunakan dalam kemoterapi modern untuk tuberkulosis, konsentrasi kritis yang direkomendasikan adalah 200 μg / ml. Namun, sampai saat ini belum ada metode yang berlaku umum untuk menentukan resistensi obat terhadap obat ini pada media nutrisi padat, karena aktivitas antibakterinya hanya termanifestasi dalam medium asam (pH <6), yang secara teknis sulit untuk dipertahankan. Selain itu, banyak kultur klinis mycobacteria tuberculosis dengan enggan tumbuh di lingkungan telur dengan lingkungan asam.

Untuk menilai kualitas hasil penentuan kepekaan obat mycobacteria, disarankan agar setiap batch baru media Levenstein-Jensen dipantau dengan penentuan sensitivitas yang ketat dari strain standar museum H37Rv. Selain itu, ada beberapa kriteria mikrobiologis yang harus dijaga agar teknik memberikan hasil yang dapat direproduksi dengan baik dan benar. Ini termasuk kelangsungan hidup dari kultur mycobacterium tuberculosis, aturan untuk mendapatkan suspensi dan suspensi homogen, aturan untuk memilih kultur mycobacterium tuberculosis, keterwakilan massa bakteri yang dipilih. Keandalan penentuan resistansi obat menurun dengan pelepasan bakteri yang sangat langka.

Baru-baru ini, sebuah metode untuk menentukan kepekaan obat dengan menggunakan sistem otomatis telah dianggap menjanjikan. Yang paling sempurna di daerah ini adalah perkembangan berbasis VASTES MGIT-960. Dalam kasus ini, sensitivitas obat mycobacterium tuberculosis ditentukan berdasarkan metode proporsi yang dimodifikasi. Dalam proses penentuan, tingkat pertumbuhan mycobacterium tuberculosis di tabung kontrol dan pada tabung reaksi dengan obat-obatan dibandingkan. Untuk mengetahui sensitivitas terhadap streptomisin, isoniazid, rifamp-picin dan etambutol, suplemen pengayaan dan antibiotik yang termasuk dalam kit SIRE digunakan. Untuk mengetahui sensitivitas pirazinamida, gunakan kit PZA. Selama uji coba, inokulum suspensi mycobacterium tuberkulosis diinokulasi dengan tabung reaksi yang berisi obat-obatan, serta tabung kontrol dengan pengenceran suspensi 100 kali untuk semua sediaan, kecuali untuk pirazinamida, di mana dilusi suspensi adalah 10 kali. Kriteria stabilitas adalah indikator pertumbuhan mikobakteri 100 GU saat pertumbuhan dicapai pada tabung kontrol 400 GU (lihat "Metode kultur untuk mengisolasi mikobakteri"). Akuntansi dan interpretasi hasilnya dilakukan secara otomatis dan ditetapkan oleh input atau program yang dipilih.

Sebagai konsentrasi kritis, konsentrasi akhir digunakan dalam tabung reaksi dengan medium nutrisi cair. Saat ini, konsentrasi kritis telah dikembangkan untuk kedua obat lini pertama dan lini kedua. Perlu dicatat bahwa sensitivitas mycobacteria tuberculosis terhadap asam sikloserin dan aminosalisilat hanya ditentukan pada media gizi telur.

Sebuah protokol kerja rinci pada sistem yang dijelaskan memungkinkan untuk mempelajari kerentanan terhadap obat baik pada kultur terisolasi (dengan media nutrisi padat) dan menggunakan pertumbuhan primer mikobakteri dalam tabung MGIT. Pilihan terakhir secara signifikan mengurangi waktu studi budaya, yang memungkinkan untuk mendapatkan hasil lengkap tentang budaya mycobacterium tuberculosis (termasuk informasi tentang kerentanan obat) sejak 3 minggu sejak pengumpulan, sementara metode tradisional hanya dapat mencapai hal ini pada bulan ke-3. Pada waktunya, hasil yang diperoleh, saat pasien dalam fase intensif pengobatan, dapat mengimbangi biaya penelitian yang relatif tinggi.

[72], [73], [74], [75], [76], [77], [78], [79]

Diferensiasi mikobakteri

Dengan mempertimbangkan bahwa media nutrisi yang digunakan tidak secara ketat selektif. Diferensiasi berikutnya dari mikobakteri terisolasi diakui sebagai wajib. Kebutuhan untuk diferensiasi mikobakteri disebabkan oleh sejumlah fitur proses patologis yang disebabkan oleh perwakilan genus: jalur dan hasil yang berbeda dari tuberkulosis dan mikobakteriosis, adanya resistensi obat alami terhadap beberapa obat anti-tuberkulosis.

Diakui bahwa identifikasi utama mikobakteri kompleks M. Tuberkulosis dari mikobakteri non tuberkulosis dilakukan sesuai dengan karakteristik berikut: laju pertumbuhan pada media nutrisi padat, pigmentasi, morfologi koloni, ketahanan asam dan suhu optimum pertumbuhan.

Sayangnya, tidak ada metode laboratorium tunggal untuk andal membedakan M. Tuberculosis mikobakteri kompleks dari yang lain basil tahan asam, namun kombinasi dari fitur yang diuraikan di atas dengan hasil yang diberikan di bawah dari sejumlah tes biokimia memungkinkan identifikasi kompleks Mycobacterium tuberculosis dengan M. Cenderung 95%.

Untuk diferensiasi Mycobacterium kompleks M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii dan lain-lain) dari mikobakteri tumbuh lambat digunakan tes biokimia dasar nontubercular yang mendeteksi keberadaan gejala berikut:

• kemampuan memproduksi asam nikotinat (uji niacin):
• aktivitas nitrat reduktase;
• katalase termostabil;
• pertumbuhan medium dengan sodium salisilat (1 mg / ml).

Sebagai tes tambahan, pertumbuhan pada media yang mengandung 500 pg / ml asam paranitrobenzoat atau 5% natrium klorida juga dapat digunakan.

Banyak laboratorium bakteriologis mengidentifikasi mikroorganisme ini hanya pada tingkat kompleks, yang disebabkan oleh terbatasnya kemampuan laboratorium dan kemampuan metodologis spesialis.

Dalam kebanyakan kasus, bagaimanapun, dalam praktek untuk membedakan M. Tuberculosis dan M. Bovis cukup tes berikut: niasin, untuk kehadiran nitrat, pendaftaran kehadiran dan pertumbuhan pirazinamidazy dalam medium yang mengandung 2 ug / ml hydrazide asam tiofen-2-karboksilat. Diperkirakan bahwa mikobakteri kompleks M. Tuberkulosis ditandai oleh rangkaian karakter berikut:

• pertumbuhan lambat (lebih dari 3 minggu);
• suhu pertumbuhan di kisaran 35-37 ^o C;
• tidak adanya pigmentasi (gading);
• ditandai warna asam cepat;
• tes niacin positif;
• tes reduktase nitrat positif;
• tidak adanya katalase termostabil (68 ^° C).
• Tidak adanya pertumbuhan media Levenstein-Jensen yang mengandung:
  • 1000 μg / ml natrium salisilat,
  • 500 pg / ml asam paranitrobenzoat,
  • 5% natrium klorida:
• pertumbuhan dengan adanya asam thiophene-2-carboxylic 1-5 μg / ml.

Relevansi diferensiasi mikobakteri terisolasi akan meningkat secara nyata seiring dengan meningkatnya frekuensi pencatatan kasus HIV / AIDS yang terkait dengan tuberkulosis atau mikobakteriosis. Saat ini, tidak ada kepastian yang mutlak tentang kesiapan laboratorium regional praktis untuk melakukan volume pekerjaan ini dengan benar.

[80], [81], [82], [83], [84], [85], [86], [87], [88]

Diagnosis imunologi tuberkulosis

Ada sejumlah fenomena universal, obat-obatan dan tes imunologi yang pada awalnya ditemukan tepat dengan tuberkulosis atau pada model respons kekebalan terhadap mikobakteri. Ini termasuk BCG dan tuberkulin, sebuah fenomena seperti GZT kulit (tes tuberkulin - reaksi Pirke dan Mantoux), sebuah reaksi terhadap injeksi tuberkulin subkutan ke hewan peka (fenomena Koch). Salah satu antibodi pertama dalam penyakit menular juga terdeteksi pada tuberkulosis. Tentu saja, semakin dalam pemahaman mekanisme kekebalan antituberkulosis dan pengendalian genetika mereka, semakin luas penggunaan metode imunologi dan obat-obatan yang mempengaruhi kekebalan tubuh untuk memecahkan masalah praktis phthisiologi.

Masalah praktis yang paling penting dan sulit saat ini dianggap sebagai deteksi tuberkulosis dalam proses penyaringan massal populasi. Namun, terlepas dari banyaknya laporan tentang "keberhasilan" (pada materi terbatas), tidak ada metode imunologis yang sesuai (dapat direproduksi dalam "senjata apapun") dan obat yang sesuai untuk tujuan ini.

Metode imunologi, khususnya penelitian serologis (penentuan antigen, antibodi) dan tes provoksi tuberkulin sangat banyak digunakan dalam praktik klinis.

Di tempat pertama di antara studi imunologi yang digunakan dalam diagnosis diferensial, ada metode serologis - penentuan antigen dan antibodi di lingkungan tubuh yang berbeda.

Spesifisitas antibodi terhadap mycobacteria tuberculosis bergantung pada antigen yang digunakan dalam immunoassay. Sejumlah antigen yang cukup diusulkan, yang pertama adalah tuberculin PPD:

• PAP dan preparat kompleks lainnya dari cairan kultur;
• disintegrasi ultrasonik;
• Ekstrak triton dan preparat kompleks lainnya dari dinding sel;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• faktor tali pusat (trehalose-6,6-di-mycollate);
• fenolik dan glikolipid lainnya;
• lipopolisakarida;
• antigen pengikatan fibronektin;
• protein (paling sering rekombinan); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, dll.

Sebagai hasil dari penelitian bertahun-tahun oleh ilmuwan Rusia dan asing, pola utama pembentukan antibodi dan efektivitas diagnosis serologis tuberkulosis terungkap: semakin kompleks antigen, semakin tinggi sensitivitas dan spesifisitas tes yang lebih rendah. Spesifisitas bervariasi dari satu negara ke negara lain tergantung pada infeksi populasi dengan M. Tuberculosis dan mikobakteri non-tuberkulosis, mulai dari vaksinasi dengan BCG, dan lain-lain. Pada anak-anak, nilai serodiagnostik lebih rendah daripada orang dewasa. Pada tuberkulosis primer (lebih sering anak-anak), definisi IgM lebih informatif. Dengan IgG sekunder. Pada pasien terinfeksi HIV, nilai serodiagnosis yang informatif dalam menentukan antibodi berkurang. Efektivitas penentuan antibodi bergantung pada sejumlah "momen klinis": aktivitas proses (ada tidaknya "isolasi" mikobakteri, adanya rongga pembusukan, tingkat infiltrasi), prevalensi proses, durasi perjalanannya.

Sensitivitas metode enzim immunoassay (ELISA) sekitar 70%. Kurangnya efektivitas penelitian ini karena spesifisitasnya rendah. Sebelumnya, kemungkinan penggunaan skrining serologis pada kelompok berisiko tinggi, khususnya di antara orang-orang dengan perubahan pasca-tuberkulosis di paru-paru, dipertimbangkan.

Untuk meningkatkan spesifisitas ELISA, mencari antigen yang lebih spesifik, termasuk yang diperoleh dengan rekayasa genetik: ESAT-6, dll. (Lihat di atas) terus berlanjut. Penggunaan antigen spesifik (38 kDa, ESAT) meningkatkan spesifisitas. Namun secara signifikan mengurangi sensitivitas analisis. Seiring dengan ELISA (sistem uji laboratorium eksperimental, misalnya kit ELISA Pathozyme), kit imunokromatografi dengan filtrasi lateral (Mycodot), dan juga tes serupa lainnya (uji dot-membrane) dengan evaluasi visual dari hasil penelitian juga disarankan. Selama pengujian ini, analisis dilakukan selama 10-30 menit; Mereka tidak memerlukan peralatan khusus, mereka memerlukan evaluasi visual dari hasil, yang dikaitkan dengan subjektivitas tertentu. Metode ini memiliki karakteristik kepekaan dan spesifisitas yang sama (masing-masing 70% dan 90-93%) sebagai ELISA tradisional.

Penggunaan metode analisis kekebalan memiliki nilai yang pasti sebagai tambahan, diperhitungkan dalam kompleks metode yang digunakan, dalam diagnosis banding tuberkulosis, terutama dalam diagnosis bentuk ekstrapulmonalnya. Metode ELISA yang paling efektif adalah dalam diagnosis meningitis tuberkulosis dalam penelitian tentang cairan serebrospinal. Dalam kasus ini, sensitivitas analisis adalah 80-85%, dan spesifisitasnya adalah 97-98%. Ada data tentang efektifitas deteksi antibodi terhadap mycobacteria tuberculosis pada cairan air mata dalam diagnosis uveitis tuberkulosis.

Induksi sintesis interferon gamma secara in vitro

Interferon gamma (IFN-γ) adalah faktor pertahanan kekebalan spesifik yang direalisasikan dengan mengaktifkan sistem enzim makrofag. Induksi sintesis IFN-γ oleh limfosit T-sensit menyebabkan interaksi mereka dengan antigen mikobakteri.

Sebagai antigen digunakan sebagai PPD tuberkulin. Dan antigen spesifik diperoleh secara genetis, khususnya antigen ESAT-6 (antigen yang disekresikan awal dengan berat molekul 6 kDa) dan CFP-10 (protein filtrat kultur, 10 kDa). Rekayasa genetika atau antigen rekombinan tidak ada dalam sel-sel vaksin BCG dan mikobakteri lainnya. Bila menggunakan tuberkulin, hasil uji induksi IFN-γ sebanding dengan hasil uji kulit tuberkulin (korelasi langsung). Bila menggunakan antigen rekayasa genetika, hasil tes lebih spesifik dan tidak tergantung pada vaksinasi BCG sebelumnya. Saat menguji orang yang divaksinasi yang tidak pernah kontak dengan infeksi tuberkulosis, spesifisitas tes adalah 99%. Sensitivitas tes di antara pasien tuberkulosis bervariasi dari 81 sampai 89%.

Tes dan alat diagnostik telah dikembangkan berdasarkan pada budidaya jangka pendek dari sel-sel atau sel mononuklear darah utuh diisolasi dari darah dengan antigen Mycobacterium tuberculosis in vitro dengan tekad selanjutnya konsentrasi IFN-γ atau dengan menghitung jumlah T-limfosit yang mensintesis IFN-γ. Konsentrasi interferon yang disintesis dalam tabung reaksi ditentukan oleh ELISA dengan menggunakan antibodi monoklonal yang mengikat IFN-γ. Kemudian, dengan mengkalibrasi standar IFN-γ, konsentrasinya ditentukan di tabung reaksi atau sumur pelat.

Saat melakukan uji Elispot, jumlah limfosit T mensintesis IFN-γ. Dihitung pada permukaan piring yang dilapisi dengan antibodi terhadap IFN-γ.

Pengembang diagnosticum berdasarkan induksi IFN-γ in vitro, yang disetujui oleh Badan Obat-obatan dan Produk AS, berpendapat bahwa tidak mungkin untuk membedakan infeksi TB laten dari tuberkulosis aktif dengan bantuan tes tersebut. Karena itu, di daerah dengan tingkat infeksi yang tinggi, tes ini tidak langsung di diagnosa. Namun, di negara kita dapat digunakan untuk membedakan infeksi tuberkulosis pada anak-anak dari alergi pasca-vaksinasi, dan untuk menilai tingkat imunitas spesifik dalam proses pengobatan.

Saat ini, sistem pengujian domestik untuk menentukan induksi sintesis IFN-γ oleh antigen tuberkulosis spesifik secara in vitro sedang dipelajari.

Status kekebalan dan tuberkulosis, imunokoreksi

Dalam proses pengobatan tuberkulosis pada manusia, terjadi perubahan antigenemia dan keadaan sistem kekebalan tubuh.

Data tentang perubahan eksudat dan jaringan sebagian besar kontradiktif. Satu-satunya hal yang dapat dicatat dengan alasan yang bagus adalah bahwa pada granuloma tuberkulosis, secara umum, sejumlah besar limfosit T yang teraktivasi terdeteksi.

Masuk akal untuk memikirkan dua ketentuan lagi yang diperlukan untuk memahami peran mekanisme imunologi dalam pengobatan tuberkulosis pada manusia:

• Pasien AIDS memiliki insidensi resistensi obat yang sangat tinggi;
• dengan beberapa resistansi obat (dan jika tidak ada infeksi HIV), gangguan kekebalan (khususnya hubungan sel T) sangat signifikan.

Ketika TBC secara luas menerapkan berbagai metode immunomodulation: itu adalah terutama obat yang bekerja terutama pada imunitas T-sel dan sistem fagosit mononuklear (hormon thymus, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Serta keseluruhan (dilemahkan) mikobakteri dan komponennya.

Diagnosis tuberkulosis molekuler-biologis

Untuk metode biologi molekuler dalam diagnosis penyakit infeksi termasuk, terutama, metode berdasarkan memanipulasi dengan bahan genom bakteri dan virus patogen untuk mengidentifikasi materi genetik tertentu - segmen DNA memiliki urutan nukleotida spesifik untuk jenis atau patogen tertentu strain untuk menganalisis tertentu Urutan DNA pada gen yang menentukan kepekaan patogen terhadap zat obat tertentu, dan juga untuk analisis fungsional aktivitas gen tertentu dari patogen. Teknik biologi molekuler secara luas dalam penelitian ilmiah dan aplikasi praktis dalam diagnosis dan pemantauan berbagai infeksi bakteri dan virus setelah membuka pada tahun 1985, Carrie Myullisom (pemenang Hadiah Nobel. 1989) polymerase chain reaction.

Prinsip dan kemungkinan metode reaksi berantai polimerase

PCR memungkinkan untuk memperkuat (multiply) in vitro urutan nukleotida (fragmen DNA patogen) selama beberapa jam dalam jutaan kali. Reaksi dengan adanya rantai DNA tunggal menentukan sensitivitas tes yang sangat tinggi.

Urutan nukleotida daerah tertentu dalam rantai DNA menentukan identitas genetik mikroorganisme, yang menjelaskan spesifisitas PCR yang tinggi.

Pentingnya metode ini untuk mendeteksi dan menyelidiki karakteristik mycobacteria tuberculosis adalah karena karakteristik biologis mikroorganisme, yang memiliki pertumbuhan sangat lambat: waktu penggandaan DNA mycobacterium tuberculosis selama kultivasi adalah 12-24 jam.

Prinsip metode PCR terdiri dari amplifikasi - beberapa, jutaan kali. Mengalikan bagian-bagian dari sekuens DNA tertentu dalam tabung microvolume selama kekambuhan siklik dari tiga tahap reaksi berikut, yang masing-masing melewati suatu suhu yang berbeda:

• Tahap I - denaturasi DNA untai ganda pada pemanasan dengan divergensi rantainya;
• II tahap - pelengkap mengikat (hibridisasi) primer (priming oligonucleotides) dengan bagian terminal rantai yang sangat spesifik, dipilih untuk perkalian fragmen DNA;
• Tahap III - penyelesaian rantai fragmen DNA menggunakan polimerase DNA termostabil.

Untuk memperkuat in vitro, harus ada molekul DNA matriks. Empat jenis deoksinukleosida trifosfat (nukleotida) yang mengandung basis nitrogen yang sesuai: adenin (A), timin (T), guanin (D), sitosin (C); artifisial disintesis oligonukleotida (primer) yang terdiri dari 18-20 pasangan basa; enzim DNA polimerase termostabil memiliki optimum suhu 68-72 ^pada C, dan ion magnesium.

Kekhususan PCR tergantung pada pilihan fragmen DNA. Sesuai dengan ini, biji panggul oligonukleotida disintesis. Spesifisitas hibridisasi dan penyelesaian rantai DNA disebabkan oleh prinsip saling melengkapi pasangan basis nitrogen berikut: adenine-timin, guanin-sitosin.

Untuk menentukan genom TB mikobakteri kompleks yang paling efisien sasaran amplifikasi di sebagian besar sistem tes yang dipilih fragmen DNA dari IS6110, yang dalam banyak strain Mycobacterium tuberculosis genom memiliki sejumlah besar (10-20) dari pengulangan, yang menyediakan, bersama dengan spesifisitas, sensitivitas tinggi dari pengujian tersebut. Pada saat yang sama strain Mycobacterium tuberculosis dengan sejumlah kecil pengulangan atau tidak adanya fragmen IS6110 dijelaskan.

Isolasi molekul DNA dari sampel biologis

Untuk melakukan PCR, molekul DNA patogen harus diisolasi dari bahan biologis dalam volume minimal, dengan jumlah minimum DNA nonspesifik dan berbagai inhibitor enzim-DNA polimerase.

Persiapan sampel harus dilakukan dalam kondisi yang mencegah kontaminasi silang sampel oleh molekul DNA yang terisolasi. Untuk melakukan ini, perawatan di muka ruangan dengan lapisan ultraviolet, lantai dan permukaan meja kerja dan peralatan kerja diperlukan dengan larutan yang mengandung klorin. Juga wajib menggunakan sarung tangan bersih, tabung uji sekali pakai dan tip untuk pipet otomatis.

Untuk mengisolasi DNA Mycobacterium tuberculosis dari spesimen klinis (cairan serebrospinal, mencuci bronkial) tidak mengandung sejumlah besar sel, debris seluler, atau garamnya, cukup untuk centrifuge sampel pada 3-4 ribu. Rpm, menambah lumpur 20-30 ul dari 2% larutan triton X-100 dan menghangat pada 90 ^tentang C selama 30 menit.

Untuk preparasi sampel dahak, diperlukan pengenceran yang efektif, dimana larutan natrium hidroksida 4% dan N-asetil-L-sistein (NALC) biasanya digunakan dalam jumlah 50-80 mg per sampel, tergantung pada viskositas sampel. Larutan NALC harus disiapkan misalnya temp tempore atau bubuk NALC dapat ditambahkan kering ke sampel secara langsung. Setelah pencairan, sampel harus disentrifugasi selama 15 menit pada 3,5-4,000 rpm (3000 g) dalam botol 50 ml dengan tutup sekrup, i. Di bawah kondisi yang sama yang direkomendasikan untuk persiapan embun beku.

Untuk mengekstrak DNA dari endapan, metode yang didasarkan pada penggunaan larutan guanidin isothiosianat 5-6 sebagai pereaksi lisis dan partikel silika mikropori ("tanah diatom"), molekul DNA sorbing sering digunakan. Zat nonspesifik, termasuk inhibitor yang mungkin, kemudian dicuci dengan larutan 2,5 molar guanidin isothiosianat dan larutan etanol, setelah itu molekul DNA diserap dalam air, dan sampel ini digunakan untuk PCR. Untuk menyederhanakan teknologi ekstraksi DNA, "diatomaceous earth" sering digantikan oleh mikropartikel magnetik yang dilapisi dengan silikon oksida. Dalam kasus ini, tempat magnet khusus untuk mikrotubes digunakan sebagai pengganti sentrifugasi untuk mengendapkan partikel.

Di Rusia, metode asli untuk pemisahan imunomagnetik mikobakteri dikembangkan, diikuti oleh ekstraksi DNA patogen. Untuk pemisahan imunomagnetik mycobacterium tuberculosis, ukuran ferrocharticles 3-5 μm dilapisi dengan silikon oksida yang digunakan, yang antibodi poliklonal (kelinci) yang terkait kimia dengan mikrolakteria tuberkulosis terhubung. Sampel sputum setelah alkali lisis dinetralisir dengan larutan tris-HCl asam dan diinkubasi dengan sorben imunomagnetik. Kemudian, immunoferropartikel dikumpulkan dengan batang magnetik dengan ujung yang dapat diganti, dipindahkan ke mikrotube, dan diendapkan. Tambahkan 20-30 μl larutan Triton X-100 2% dan hangatkan selama 30 menit pada 90 ^° C. Supernatan digunakan sebagai template DNA untuk analisis PCR.

Masalah yang sulit adalah isolasi DNA mycobacterium tuberculosis dari spesimen biopsi. Untuk biopsi enzim, enzim proteinase K digunakan pada konsentrasi akhir 200-500 mg / l pada suhu 56 ^° C semalam. Selanjutnya, salah satu metode yang diketahui digunakan. Kelebihan DNA nonspesifik dalam analisis PCR biopsi sering menyebabkan penghambatan reaksi, yang memerlukan ekstraksi DNA berulang.

Metode untuk mendeteksi hasil

Setelah selesainya reaksi, fragmen DNA yang diperkuat dari patogen diidentifikasi dengan berbagai metode.

Metode elektroforesis gel sudah dikenal. Fragmen DNA yang dihasilkan diidentifikasi dengan kontrol positif yang mengandung fragmen DNA spesifik yang diinginkan, atau sesuai dengan ukuran yang diketahui (jumlah pasangan nukleotida) fragmen, yang ditentukan dengan menggunakan penanda molekuler standar.

Dengan adanya zat warna tertentu, etidium bromida termasuk dalam DNA beruntai ganda. Fragmen DNA yang disintesis dideteksi sebagai band bercahaya di bawah aksi ultraviolet.

Ukuran fragmen DNA, yang ditentukan oleh elektroforesis dari jarak dari awal, harus sesuai dengan penanda berat molekul atau kontrol positif yang diketahui.

Metode lain untuk menentukan hasil PCR berdasarkan hibridisasi dari rantai tunggal produk PCR dengan oligonukleotida komplementer dengannya - DNA Probe diberi label dengan biotin, diikuti oleh deteksi melalui reaksi enzimatik, misalnya dengan mengikat streptavidin-biotin alkali fosfatase.

Berdasarkan jenis deteksi ini, analisa PCR telah dibuat dimana deteksi hasil PCR dilakukan secara otomatis sebagai hasil dari membaca kerapatan optik pada sampel setelah manifestasi reaksi enzimatik.

Kelemahan dari metode ini adalah kemungkinan kontaminasi intralaboratif oleh fragmen molekul DNA yang agak pendek. Ketika molekul memasuki sampel baru, mereka menjadi matriks PCR dan menyebabkan hasil positif palsu.

Dalam hal ini, untuk mencegah hasil positif palsu, peraturan ketat untuk pemisahan dan isolasi tempat diperkenalkan: untuk mengekstrak DNA dari sampel biologis; tempat untuk mendeteksi hasil (elektroforesis) dari zona bersih. Tempat ini merupakan zona kemungkinan kontaminasi. Daerah terisolasi lainnya adalah ruang bersih untuk mengenalkan sampel DNA yang akan diuji dalam tabung dengan campuran reaksi untuk PCR. Akhirnya, diasumsikan bahwa perangkat utama - penguat DNA - harus ditempatkan di ruangan terpisah, mungkin kantor.

Untuk mencegah kontaminasi oleh produk dari reaksi sebelumnya - amp-lycones, beberapa sistem uji PCR dan bukan deoxynucleoside-timidine mengandung deoxynucleosiduridine, yang jika disintesis secara in vitro dimasukkan ke tempatnya pada posisi yang sesuai, mis. Basa nitrogen timin hadir dalam DNA asli digantikan oleh urasil. Uracil-DNA glycosylase, ditambahkan ke campuran reaksi pada bahan yang dianalisis, hanya menghancurkan fragmen kontaminan dengan deoxyuridine, namun DNA asli tidak dianalisis. Lt; / RTI & gt; Pemanasan selanjutnya pada ^suhu 94 ^° C menonaktifkan enzim ini dan tidak mengganggu amplifikasi PCR.

Ada sistem uji berdasarkan amplifikasi isotermal rRNA, yang mana transkripsi dan sintesis reverse molekul DNA dilakukan lebih dulu. Yang, pada gilirannya, adalah matriks untuk sintesis selanjutnya dari molekul RNA. Amplitudo RNA dideteksi dengan menggunakan probe DNA bernoda akridin saat dihibridisasi dalam larutan tabung reaksi. Metode ini, selain sensitivitas tinggi, memiliki keuntungan menganalisa dalam satu tabung, yang mencegah kontaminasi. Menurut penulis, sensitivitas metode ini pada sampel pernafasan mencapai 90% dengan spesifisitas 99-100%.

Metode deteksi baru diimplementasikan secara real-time PCR. Metode ini berbeda terutama pada PCR dan pendeteksian hasilnya dilakukan secara bersamaan dalam satu tabung tertutup. Ini tidak hanya secara teknologi menyederhanakan teknik analisis, namun juga mencegah kontaminasi ruang laboratorium dan sampel uji dengan produk PCR sebelumnya.

Dengan PCR real-time, pendeteksian hasilnya disebabkan oleh fluoresensi yang timbul dari hibridisasi probe DNA fluorogenik dengan fragmen DNA tertentu yang diperkuat selama PCR. Struktur probe DNA fluorogenik dibangun sedemikian rupa sehingga penanda fluoresen dilepaskan sebagai hasil reaksi enzimatik atau jarak itu sendiri dari molekul agen pendinginan fluoresensi hanya pada hibridisasi spesifik dengan molekul DNA yang diinginkan yang diperkuat selama PCR. Dengan bertambahnya jumlah molekul yang dihibridisasi dengan probe, peningkatan fluoresensi ke tingkat yang terdeteksi sebanding dengan jumlah molekul produk yang diperkuat. Karena jumlah molekul fragmen DNA berlipat ganda selama setiap siklus PCR, jumlah siklus dari mana fluoresensi ditentukan dan kenaikannya berbanding terbalik dengan jumlah molekul DNA dalam sampel aslinya. Jika beberapa konsentrasi molekuler yang diketahui dari fragmen DNA mycobacterium tuberculosis yang sesuai dimasukkan ke dalam reaksi sebagai kalibrator, maka oleh program komputer jumlah genom DNA dalam bahan uji dapat dihitung.

Setiap sampel standar diduplikasi. Kriteria kuantitatif adalah jumlah minimum siklus PCR yang diperlukan untuk onset dan pertumbuhan fluoresensi yang ditentukan. Pada absis - jumlah siklus; ordinatnya adalah nilai fluoresensi. Konsentrasi DNA berbanding terbalik dengan jumlah siklus yang dibutuhkan untuk munculnya fluoresensi. Di kolom kanan (21-32), nomor siklus untuk konsentrasi yang sesuai ditandai. Perbedaan antara konsentrasi fragmen DNA 10 kali lipat 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 siklus. Untuk dua pasien, konsentrasi fragmen IS6110 sekitar 10 ³ / ml dan 10 ⁴ / ml. Dengan mempertimbangkan jumlah pengulangan (6-20) fragmen yang dianalisis dalam genom Mycobacterium tuberculosis, jumlah bakteri myco dalam sampel klinis masing-masing sekitar 100 dan 1000.

Penggunaan PCR dalam diagnosis tuberkulosis

Metode PCR paling banyak digunakan untuk diagnosis TB yang dipercepat - deteksi tuberkulosis mycobacterium pada spesimen klinis: dahak. Pembilasan bronkial, eksudat pleura, urin, cairan serebrospinal, tanda baca osteolisis, aspirasi saluran kelamin wanita dan berbagai spesimen biopsi. Ketika mempelajari sekitar 500 sampel dahak dan flushes bronkial dari 340 pasien dengan diagnosis TB paru yang dikonfirmasi di Belanda, sensitivitas komparatif PCR, kultur dan mikroskop smear dipelajari. Sensitivitas analisis masing-masing adalah 92,6,88,9 dan 52,4%. Spesifisitas semua metode adalah sekitar 99%.

Efektivitas deteksi mycobacterium tuberculosis oleh mikroskop smear, pembibitan pada media Levenstein-Jensen, sistem uji VASTES dan analisis PCR dibandingkan. PCR menunjukkan sensitivitas 74,4%, mikroskop - 33,8%, pembenihan pada media padat - 48,9% dan VASTES - 55,8%. Waktu pendeteksian rata-rata untuk pembibitan pada media Levenstein-Jensen adalah 24 hari. VASTES - 13 hari, PCR - 1 hari.

Kemungkinan penggunaan PCR sebagai metode sensitif dan cepat untuk memantau efektivitas pengobatan TBC juga dibahas.

Deteksi DNA mycobacteria tuberculosis oleh PCR dengan kemoterapi yang efektif ditentukan untuk waktu yang lebih lama - rata-rata 1,7 bulan dibandingkan dengan pelepasan bakteri, yang ditentukan oleh mikroskop luminescence, dan 2,5 bulan dibandingkan dengan studi bakteriologis.

Diagnosis bentuk tuberkulosis ekstrapulmoner

Arti penting PCR sebagai metode sensitif sangat bagus untuk bentuk ekstrapulmoner, karena dengan bentuk inilah metode klinis-radiologis dan metode bakteriologis tradisional untuk menentukan mikobakteri tuberkulosis dalam bahan diagnostik tidak efektif.

Dalam studi sampel urin, hasil analisis PCR positif pada 16 dari 17 pasien dengan tuberkulosis aktif pada sistem saluran kemih dan negatif pada 4 pasien dengan tuberkulosis ginjal tidak aktif dan 39 pasien dengan penyakit non-tuberkulosis pada sistem saluran kemih.

Efektivitas analisis PCR dalam studi aspirasi sumsum tulang pada pasien dengan demam yang tidak diketahui berasal dari kasus dugaan tuberkulosis. Untuk mendiagnosa limfadenitis tuberkulosis, 102 aspirasi tusukan dan spesimen biopsi terhadap 67 anak dengan dugaan limfadenitis tuberkulosis dipelajari pada anak-anak. Hasil positif diperoleh: 71,6% PCR real-time. Mikroskop fluoresensi - 46,3%. Penelitian budaya - 41,8%. Dalam studi 50 biopsi kelenjar getah bening pada pasien dengan penyakit "cat scratch", semua hasilnya negatif. Jadi, spesifisitas 100% analisis PCR ditunjukkan. Dalam pekerjaan yang sama, dengan biopsi tusukan dari kelenjar getah bening, kemungkinan deteksi M. Avium ditunjukkan.

Diagnosis tuberkulosis pada daerah genital wanita infertilitas, seperti diketahui, adalah salah satu masalah diagnosis yang paling sulit. Dalam studi PCR tentang biopsi endometrium, aspirasi endometrium dan sampel cairan dari ruang Douglas, 14 (56%) dari 25 pasien yang diperiksa laparoskopi dengan dugaan tuberkulosis mendapat hasil positif. Dengan menggunakan mikroskop dan mikroskopi smear, diperoleh hasil 1 dan 2. Kasus-kasus ini juga positif PCR. Sebagian besar hasil positif PCR terkait dengan kasus dengan tanda khas tuberkulosis menurut studi histologis; jumlah yang lebih kecil - dengan kecurigaan tuberkulosis menurut data laparoskopi. Hanya satu hasil positif dari analisis PCR yang diperoleh tanpa data laparoskopi untuk tuberkulosis.

Saat mendiagnosis bentuk tuberkulosis ekstrapulmonal, dokter sering memiliki pertanyaan tentang kemungkinan mendeteksi patogen saat menguji sampel darah dengan metode PCR. Data literatur menunjukkan bahwa deteksi DNA dari mycobacterium tuberculosis dari sampel darah dimungkinkan dengan bentuk infeksi HIV yang jauh. DNA mycobacterium tuberculosis hanya dideteksi dengan tuberkulosis umum dari berbagai organ pada pasien dengan transplantasi ginjal dan imunosupresi.

[89], [90], [91], [92], [93], [94], [95]

Identifikasi spesies mikobakteri

Metode PCR bisa sangat efektif untuk identifikasi cepat mikobakteri kompleks tuberkulosis dan beberapa jenis mikobakteri nontuberculous setelah mendapatkan pertumbuhan primer mereka. Dalam hal ini, penggunaan PCR dapat menghemat 7-10 hari, diperlukan untuk identifikasi budaya berikutnya dari hasil yang positif. Tes PCR secara teknis sangat sederhana, karena tidak memerlukan persiapan sampel bahan klinis yang rumit untuk mencapai sensitivitas tinggi. Dalam studi terhadap 80 budaya positif dalam sistem uji ini (MB VaT Organon), semua hasil analisis PCR yang positif sangat spesifik dan dilakukan selama 1 hari. Untuk mengidentifikasi spesies lain dari mikobakteri dalam penyusunan DNA dari budaya patogen hibridisasi dengan probe DNA spesifik dilabeli dengan acridine dan strain terdeteksi oleh penampilan chemiluminescence melalui chemiluminometer atau nitroselulosa strip dengan penilaian visual setelah hibridisasi. Dengan bantuan seperangkat itu, sejumlah spesies diidentifikasi: komplek mycobacterium tuberculosis. M. Avium, kompleks M. Avium, M. Kansasii dan M. Gordonae.

A.Telenti et al. Juga telah mengembangkan metode yang relatif sederhana dan murah untuk identifikasi spesies jenis mikobakteri yang penting secara klinis berdasarkan PCR dan selanjutnya diobati dengan dua enzim restriksi (enzim dengan sifat pembedahan molekul DNA pada titik-titik tertentu). Fragmen DNA diperkuat. Yang mengkodekan protein kejutan panas (65 kDa), dan kemudian fragmen PCR dari 439 pasangan nukleotida yang diproduksi oleh PCR diperlakukan secara terpisah dengan dua enzim, Bste II dan Nae III. Kemudian, dengan menggunakan elektroforesis gel agarose, kedua produk yang diperoleh dianalisis dengan menentukan ukurannya (jumlah pasangan nukleotida) dengan menggunakan sekumpulan fragmen DNA standar (penanda DNA molekuler) dengan panjang 100 sampai 1000 pasangan nukleotida. Pada masing-masing spesies spesifik (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum), 2 atau 3 fragmen DNA dengan ukuran berbeda terdeteksi untuk setiap enzim restriksi. Kombinasi berbagai ukuran DNA yang diperoleh memungkinkan membedakan spesies ini di antara mereka sendiri.

Teknologi microarray DNA biologis sedang dikembangkan. Yang akan membantu mengidentifikasi lebih dari 100 spesies mikobakteri dalam satu penelitian.

Identifikasi spesies juga dapat dilakukan dengan amplifikasi PCR pada daerah variabel 16S rRNA diikuti dengan urutan amplikon bila dibandingkan dengan struktur primer yang sesuai, yang memungkinkan identifikasi lebih dari 40 spesies mikobakteri.

Dengan bantuan PCR, identifikasi spesies di dalam kompleks mycobacterium tuberculosis juga dapat dilakukan, termasuk diferensiasi M. Bovis dan M. Bovis BCG. Untuk melakukan ini, ada tidaknya gen di daerah genom RD1 dianalisis. RD9 dan RD10. RD1 tidak ada di M. Bovis BCG, namun ada pada spesies ganas, termasuk M. Bovis.

Penentuan sensitivitas obat Mycobacterium tuberculosis oleh PCR

Tugas metode genetika molekuler untuk menentukan kerentanan atau resistensi obat mycobacterium tuberculosis dikurangi untuk mendeteksi mutasi pada urutan nukleotida tertentu dari gen yang diketahui. Metode utama didasarkan pada pembacaan langsung (sequencing) sekuensing ini setelah amplifikasi, atau pada hibridisasi fragmen DNA berlabel biotin yang diperkuat selama PCR dengan probe DNA. Kedua varian tersebut menyarankan pendeteksian substitusi dalam urutan nukleotida yang, jika menggunakan probe DNA, menyebabkan tidak adanya hibridisasi yang tidak adekuat pada membran nitroselulosa dengan konjugat enzim (streptavidin-alkaline phosphatase) - metode LIPA-Rif-TB.

Metode untuk mengukur fluoresensi dalam lokal tetap pada microsections DNA probe melengkapi mutasi dikenal di daerah gen PCR diamplifikasi bertanggung jawab untuk ketahanan atau sensitivitas obat, yang disebut mikrobiochipov metode. Algoritma utama untuk melaksanakan penelitian ini adalah sebagai berikut. Setelah mengisolasi DNA dari sampel klinis atau budaya mikobakteri perlu dilakukan PCR amplifikasi fragmen yang relevan dari gen rpoB bertanggung jawab untuk sensitivitas obat rifampisin atau gen katG dan Inha pengkodean protein dari Mycobacterium bertanggung jawab untuk kepekaan terhadap isoniazid. Hasil PCR dievaluasi dengan elektroforesis gel agarose, di mana fragmen DNA yang sesuai dengan panjang yang diinginkan dikonfirmasi. Kemudian, putaran kedua PCR dilakukan untuk mengenalkan label fluoresen ke dalam DNA. Hasil PCR kembali dikonfirmasi dengan elektroforesis gel. Setelah itu, hibridisasi dilakukan (inkubasi semalam), diikuti dengan mencuci bahan yang dihasilkan pada biochip, yang merupakan sejumlah besar tetap di piring kaca kecil untai DNA pendek (probe) yang melengkapi nukleotida urutan dari jenis Mycobacterium tuberculosis yang peka terhadap obat pada titik-titik yang mungkin mutasi. Serta urutan mutan yang bertanggung jawab atas resistansi obat. Lokasi probe DNA di piring didefinisikan secara ketat, dan tingkat fluoresensi yang diamati selama hibridisasi ditentukan untuk menentukan hasilnya dengan menggunakan pembaca khusus. Dalam hal ini, hasil analisis ditentukan dengan menggunakan program komputer khusus.

Dalam beberapa tahun terakhir, metode alternatif untuk menentukan sensitivitas obat mycobacteria tuberculosis berdasarkan teknologi PCR real-time telah dikembangkan, yang memungkinkan dilakukannya penelitian ini dalam uji tabung tertutup.

Pada Gambar. 13-13 menyajikan hasil analisis kultur klinis mycobacterium tuberculosis dalam penentuan resistansi obat terhadap rifampisin dengan PCR real-time: 218 - sampel kontrol (sensitif terhadap rifampisin); 93 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - sampel percobaan. Hasil perhitungan kurva kinetik amplifikasi pada 4 saluran: saluran 1: 393 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; saluran 2: 4482 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - sampel percobaan; saluran 4: kurva kinetik amplifikasi semua sampel yang berpartisipasi dalam percobaan. Kontrol positif terhadap reaksi amplifikasi. Kesimpulan: Berdasarkan hasil analisis, mutasi berikut yang menentukan ketahanan terhadap rifampisin diidentifikasi: pada sampel 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Prinsip yang sama digunakan untuk menentukan resistansi obat terhadap isoniazid untuk gen katG dan inhA, yang menentukan mutasi yang paling sering terjadi.

[96], [97], [98], [99], [100], [101], [102], [103], [104]

Identifikasi strain mycobacterium tuberculosis

Metode yang paling menyeluruh dipelajari dari identifikasi strain Mycobacterium tuberculosis adalah teknik yang disebut pembatasan panjang fragmen polymorphism (RFLP RFLP,. Atau dalam versi bahasa Inggris) dan yang didasarkan pada fragmentirovanin (pembatasan) enzim DNA Mycobacterium tuberculosis PVU II dan fragmen diperoleh hibridisasi selanjutnya dengan urutan tertentu tertentu pada DNA elemen berulang IS6110. Variabilitas intrinsik direalisasikan karena perbedaan jumlah pengulangan IS6110 dan lokasi DNA mereka. Serta variasi jarak antara titik-titik serangan enzim restriksi enzim tertentu (tempat restriksi) dan elemen IS6110. Teknologi ini sangat rumit dan memakan waktu. Setelah pengobatan dengan DNA diekstraksi dari budaya Mycobacterium tuberculosis, elektroforesis gel dilakukan dengan enzim restriksi, dan kemudian ditransfer fragmen DNA dengan panjang yang berbeda pada membran nitroselulosa, hibridisasi dilakukan dengan fragmen dari IS6110-elemen dan dideteksi dengan menggunakan reaksi enzimatik. Pola spesifik yang dihasilkan dari band mencirikan DNA strain spesifik Mycobacterium tuberculosis. Dengan bantuan analisis komputer, identitas atau keterkaitan strain terungkap. Terlepas dari kenyataan bahwa metode RFLP adalah yang paling diskriminatif, yaitu Mengungkapkan perbedaan terbesar dalam strain yang dianalisis, tidak efektif dengan jumlah kecil (kurang dari 5) pengulangan IS6110 yang diamati pada beberapa strain. Pada Gambar. 13-14 menunjukkan hasil RFLP-mengetik strain.

Alternatif lain mungkin adalah metode spoligotip - analisis polimorfisme sekuens spacer DNA - antara antara pengulangan langsung daerah DR. Saat melakukan spoligotip pada strain, PCR dilakukan dengan primer yang melintasi daerah DR, setelah fragmen-fragmen panjang yang berbeda dibentuk yang menghibridisasi dengan daerah antara DNA. Analisis urutan spacer dari daerah DR disajikan. Menurut peneliti, lebih sederhana, produktif dan cocok untuk skrining primer strain dan analisis epidemiologis awal, serta penelitian secara langsung bahan klinis.

Jelas, metode yang lebih efektif dan dapat diakses secara teknologi adalah VNTR (singkatan dari kata-kata dalam bahasa Inggris), atau metode untuk menentukan jumlah variabel pengulangan tandem yang tepat dalam DNA mycobacterium tuberculosis. Metode ini hanya didasarkan pada penggunaan PCR dan tidak memerlukan manipulasi tambahan. Karena jumlah pengulangan tandem pada strain yang berbeda dan pada lokus yang berbeda berbeda, fragmen dengan ukuran berbeda ditentukan dan dianalisis pada elektroforesida yang dihasilkan dari produk PCR. Menurut peneliti, menggunakan VNTR mencapai tingkat diskriminasi jenis yang lebih tinggi daripada metode RFLP.

Banyak perhatian telah dibayarkan dalam beberapa tahun terakhir dengan distribusi strain Mycobacterium tuberculosis dari keluarga W-Beijing (kadang-kadang disebut strain Beijing), yang sebagian besar resistan terhadap obat.

Persyaratan dasar untuk kualitas penelitian biologi molekuler

[105], [106], [107], [108], [109], [110]

Dokumen peraturan dasar untuk PCR

Pesanan dari Kementerian Kesehatan Federasi Rusia: No. 45 dari 7.02.2000 Nomor 109 dari 21.03.2003 Nomor 64 dari 21.02.2000 Petunjuk metodis: 1.3.1888-04 "Organisasi pekerjaan dalam penelitian yang menggunakan metode PCR dari bahan yang terinfeksi dengan patogen biologis agen kelompok III-IV patogenisitas "; 1.3.1794-03 "Organisasi pekerjaan dalam mempelajari materi PCR, terinfeksi mikroorganisme kelompok patogenisitas I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Dekontaminasi bahan studi yang terinfeksi bakteri kelompok patogenisitas I-IV oleh PCR", 2001. Lampiran 11 pada Instruksi Metode Unified Penelitian Mikrobiologi untuk Deteksi, Diagnosis dan Pengobatan Tuberkulosis.

[111], [112], [113], [114]

Stafnya

Diagnostik laboratorium klinis, dokter bakteriologis, ahli virologi, ahli biologi dari laboratorium diagnostik klinis, serta spesialis dengan pendidikan medis sekunder, yang telah lulus spesialisasi dan pelatihan lanjutan dalam tatanan yang telah mapan, dapat melakukan studi biologi molekuler.

Pengaturan tempat laboratorium

Kamar laboratorium berikut diperlukan:

• Area penanganan sampel adalah laboratorium yang disesuaikan untuk bekerja dengan agen infeksi dari kelompok patogenisitas III-IV, menurut Instruksi Metodis 13.1888-04.
• Zona untuk persiapan campuran reaksi PCR - ruang laboratorium, yang memberikan perlindungan dari kontaminasi laboratorium internal - zona "bersih".
• • Jika elektroforesis atau hibridisasi digunakan untuk menganalisis produk PCR. Ruang laboratorium dimana fragmen DNA berlipat diekstraksi dari tabung amplifikasi dan, karenanya, dapat memasuki lingkungan, sesuai dengan persyaratan untuk laboratorium PCR (Pedoman 1.3.1794-03, Pedoman 1.3.1888-04) harus sepenuhnya diisolasi dari tempat yang ditunjukkan dalam paragraf sebelumnya. Pergerakan dari daerah elektroforesis ke area penanganan sampel dan zona "bersih" dari setiap personil, peralatan, bahan dan benda apapun, serta transportasi udara melalui sistem ventilasi atau akibat draft, harus dihindari. Zona ini tidak diperlukan untuk deteksi fluorimetri produk PCR.
• Ruang untuk dokumentasi dan pengolahan hasil dilengkapi dengan komputer dan peralatan kantor yang diperlukan. Ruangan ini mungkin berisi peralatan yang menyediakan deteksi produk PCR tanpa membuka tabung. - Detektor PCR neon dan cyclers termal untuk PCR real-time.

Persyaratan sanitasi dan epidemiologi untuk pengobatan utama sputum serupa dengan persyaratan mikrobiologi standar untuk bekerja dengan mycobacteria tuberculosis.

[115], [116], [117], [118], [119]

Penyelesaian peralatan laboratorium untuk diagnostik PCR

Laboratorium meliputi peralatan untuk ruangan berikut.

• ruang untuk preparasi sampel, berisi peralatan berikut: laminar kelas II perlindungan "SP-1.2": termostat solid-state dengan penutup pemanas untuk tabung reaksi tipe "Eppendorf"; microcentrifuge pada 13.000 rpm; sebuah centrifuge (Vortex); Kulkas dengan rentang suhu dari -20 ^о С sampai +10 ^о С; pipet dari volume variabel dari seri "Rroline"; sebuah pompa dengan labu perangkap OM-1; tripod untuk pipet; tripod workstation 200x0.5 ml; tripod workstation 50x1.5 ml; Sisi untuk menyimpan tabung uji 80x1.5 ml;
• Ruang preparasi campuran reaksi: ruang PCR-kotak pelindung ("Laminar-C 110 cm); centrifuge - Vortex; Pipet volume variabel dari seri Proline; tripod untuk pipet; tripod workstation 200x0.2 ml; Sisi untuk menyimpan tabung uji 80x1.5 ml; Kulkas dengan rentang suhu mulai dari -20 ^о С sampai +10 ^о С;
• ruang untuk elektroforesis: kamera untuk elektroforesis horisontal; catu daya; transilluminator;
• Amplifier DNA atau analisa asam nukleat (PCR secara real time) dengan komputer dan perangkat lunak; bisa diletakkan di kamar kosong. Jika teknologi PCR real-time digunakan. Ruang untuk elektroforesis tidak diperlukan.

[120], [121], [122], [123], [124]

Kontrol kualitas eksternal

Agar percaya diri dalam mendapatkan hasil yang dapat dipercaya secara obyektif, laboratorium harus berpartisipasi dalam sistem evaluasi eksternal terhadap kualitas penelitian laboratorium.

Peserta dalam sistem kontrol kualitas menerima; 12 ampul dengan suspensi terliofilisasi sel bakteri, dua di antaranya mengandung E. Coli E. Coli, 3 ampul dengan mycobacterium tuberculosis (regangan avirulen) pada konsentrasi 10 ² / ml; 3 ampul dengan sel dengan regangan serupa dalam konsentrasi 10 ⁴ / ml; 2 ampul dengan mikobakteri non-tuberkulosis M. Avium-intracellulare dan M. Kansasii dalam konsentrasi 10 ⁵ / ml.

Tes terdistribusi untuk penilaian kualitas eksternal telah diuji sebelumnya di dua laboratorium independen dengan pengalaman luas di bidang ini.

[125], [126], [127], [128]