Sel punca embrionik

Penemuan sel punca embrionik tidak muncul secara kebetulan, tetapi muncul di atas dasar penelitian ilmiah yang telah dipersiapkan di bidang biologi perkembangan. Istilah "sel punca" diperkenalkan ke dalam dunia kedokteran pada tahun 1908 di kongres masyarakat hematologi di Berlin oleh Alexander Maximov dalam kaitannya dengan sel hematopoietik. Jauh sebelum isolasi dan produksi garis stabil sel punca embrionik pluripoten, sel terato-(embrio-karsinoma) punca digunakan dalam studi proses perkembangan awal, dengan bantuan mekanisme embriogenesis yang tidak diketahui dipelajari, termasuk urutan ekspresi gen awal dan produk protein dari aktivitasnya.

Tetapi apakah totipotensi genom manusia hilang tak terelakkan dalam proses evolusi? Tidak, dan embriogenesis adalah buktinya. Jika demikian, kapan, pada prinsipnya, jalur kedua perkembangan evolusi akan terwujud? Mungkin, ketika manusia memasuki ruang angkasa, di mana kondisi lingkungan akan relatif konstan untuk waktu yang cukup lama. Hilangnya jaringan tulang (demineralisasi tulang dalam keadaan tanpa bobot), yang sangat lambat mengalami perombakan dan regenerasi, dapat dianggap sebagai langkah pertama dalam proses adaptasi manusia, sebagai spesies, terhadap keberadaan dalam kondisi ruang angkasa. Namun, harga untuk jalur kedua perkembangan evolusi akan berbeda - harga untuk kembalinya totipotensi dan plastisitas absolut ke semua sel adalah kemandulan. Jadi, di dunia "bunglon evolusi" ini, kita harus bereproduksi tanpa meiosis, dengan bertunas. Tetapi kita akan hidup lama. Keabadian telomerase adalah keabadian amuba. Dalam organisme multiseluler, sel punca adalah substrat umur panjang kuantitatif dan kualitatif.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Sumber sel induk embrionik

Saat ini, sumber sel punca embrionik untuk penelitian laboratorium adalah galur teratokarsinoma tikus (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) dan teratokarsinoma manusia (NTERA-2, TERA-2, klon H-9), serta galur ESC Trauneon. Akan tetapi, ketersediaan paspor sel terperinci yang menunjukkan fenotipe imun, hasil analisis kromosom, profil ekspresi mRNA, reseptor yang terekspos, dan protein pensinyalan intraseluler tidak mengimbangi kekurangan signifikan galur ESC teratokarsinoma - hilangnya totipotensi yang cepat dan ketidakmungkinan menggunakannya dalam uji klinis, sementara diferensiasi campuran dalam kultur membuatnya sangat sulit untuk mengisolasi galur khusus murni dari populasi sel heterogen. Oleh karena itu, sumber garis ESC yang dibuat untuk tujuan klinis biasanya adalah massa sel bagian dalam blastokista, blastomer individu dari embrio tahap 8 sel, sel morula tahap selanjutnya, serta sel germinal primordial.

Perlu dicatat bahwa sel teratokarsinoma, meskipun memiliki sifat pluripotensi, dicirikan oleh potensi pluripotensi yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan sel punca embrionik. Integrasi sel-sel tersebut dengan sel embrionik jarang mengarah pada pembentukan chimera, yang, terlebih lagi, tidak pernah membentuk gamet dengan genotipe sel teratokarsinoma. Dipercayai bahwa hal ini disebabkan oleh seringnya terjadinya kelainan kromosom selama pembudidayaan sel teratokarsinoma: hilangnya kromosom Y, berbagai trisomi, delesi atau translokasi.

Upaya untuk mengisolasi garis sel ESC manusia telah dilakukan berulang kali, tetapi tugas ini belum terpecahkan, karena blastokista manusia normal sulit diakses. Selain itu, frekuensi kelainan kromosom pada manusia lebih tinggi daripada pada embriogenesis hewan. Sebagian besar embrio manusia awal yang diperoleh setelah fertilisasi in vitro menunjukkan mosaikisme kromosom yang kacau dan sering kali memiliki penyimpangan numerik dan struktural. Bahkan kemudian, pada tahap blastokista, hanya 20-25% embrio manusia yang terdiri dari sel-sel dengan kariotipe normal. Hampir tidak mungkin menggunakan embrio tersebut untuk membuat sel ESC, karena zigot biasanya dikulturkan hingga tahap dua atau empat blastomer dan kemudian ditransplantasikan ke rahim. Baru-baru ini teknik yang andal untuk mengkulturkan sel telur manusia yang telah dibuahi hingga tahap blastokista dikembangkan. Pengenalan teknik ini ke dalam praktik fertilisasi in vitro tidak hanya meningkatkan frekuensi hasil implantasi yang berhasil, tetapi juga membuat blastokista normal menjadi objek yang lebih mudah diakses.

Sumber sel punca pluripoten lainnya adalah sel germinal primordial, yang, tidak seperti populasi progenitor epitel germinal yang lebih maju, tidak memiliki beta-integrin pada permukaannya, tetapi mengekspresikan aktivitas alkali fosfatase yang tinggi. Perlu dicatat bahwa populasi sel punca yang terbentuk dari sel germinal primordial telah dipelajari secara eksperimental sejak tahun 1980-an. Pada saat itu, sebuah teknik untuk mengisolasi sel germinal primordial dari rudimen gonad embrio tikus dikembangkan. Hasil pertama yang tidak berhasil dari kultur sel germinal primordial secara in vitro menunjukkan kesia-siaan upaya ini, karena sel-sel tersebut, meskipun bertahan hidup, tidak berkembang biak dan mati dalam hari pertama. Kemudian ditetapkan bahwa sel germinal primordial tikus bereproduksi secara in vitro hanya dengan adanya faktor pertumbuhan polipeptida spesifik yang larut dan terikat membran dalam media kultur. Hasil berbagai penelitian menunjukkan bahwa untuk kelangsungan hidup dan perkembangbiakan sel germinal primer, keberadaan LIF dan faktor Steel (SIF) yang terikat membran dan larut dalam medium kultur diperlukan. Peptida ini diproduksi oleh sel somatik embrio homozigot untuk mutasi Steel, dan salah satunya adalah ligan proto-onkogen cKit.

Sel germinal primer mamalia dan manusia memiliki asal ekstragonad dan merupakan sumber perkembangan klonal dari garis sel germinal. Asal garis sel germinal primordial, serta semua jaringan embrionik dan mesoderm ekstraembrionik, adalah epiblas (ektoderm primer) dari embrio awal, yang memiliki organisasi struktural mosaik. Dengan menggunakan metode pengangkatan mikrosurgis dari berbagai bagian embrio awal, zona lokalisasi dalam epiblas klon prekursor berkomitmen sel germinal primordial ditetapkan. Dengan menggunakan rhodamin dekstran, yang digunakan sebagai penanda sel, ditetapkan bahwa prekursor sel germinal primordial terlokalisasi di daerah proksimal epiblas, dekat ektoderm ekstraembrionik. Garis sel germinal primordial muncul dari klon 45 sel, yang alokasinya terjadi pada awal gastrulasi. Kemudian klon tersebut terpisah, dan selama gastrulasi sel germinal primer memasuki mesoderm ekstraembrionik dan ditemukan di dasar rudimen allantois, di belakang garis primer. Dari sana sel germinal primer bermigrasi ke bagian ventral endoderm usus belakang dan kemudian secara aktif bergerak di sepanjang mesenterium, mengisi tonjolan genital pada akhir migrasi. Selama migrasi, serta dalam 2-3 hari pertama lokalisasi di rudimen gonad, sel germinal primer secara aktif berkembang biak dan menjalani delapan siklus replikasi. Jika pada awal migrasi terdapat sekitar 50 sel germinal primer, maka di tonjolan genital embrio tikus pada dua belas hari perkembangan jumlah sel germinal primer melebihi 25.000.

Kesamaan fungsional sel germinal primer dan sel germinal primordial dibuktikan dengan integrasi lengkap sel germinal primer ke dalam blastokista dengan penggantian massa sel internal dan perkembangan embrio yang lengkap, yang jaringannya hanya terdiri dari keturunan sel germinal primordial. Dalam sifat-sifat lainnya, sel germinal primordial tikus juga ternyata identik dengan sel germinal primer, yang menunjukkan kemampuan untuk berdiferensiasi dalam berbagai arah, membentuk badan embrioid secara in vitro, dan membentuk teratoma secara in vivo ketika diberikan secara subkutan kepada tikus yang mengalami defisiensi imun, menyerupai teratoma testis spontan pada tikus 129/ter.

Ditemukan bahwa ketika LIF, SIF yang terikat membran, dan SIF yang larut ditambahkan ke dalam medium, sel germinal primer yang terisolasi dari embrio tikus berusia 8 hari bertahan hidup dan bereproduksi dalam kultur selama 4 hari, tetapi kemudian mati. Selain itu, periode ketika kematian sel germinal primer diamati dalam kultur bertepatan dengan tahap perkembangan embrio tikus (12,5-13,5 hari) ketika sel germinal primer betina memasuki meiosis dalam rudimen gonad, dan pembelahan mitosis diblokir dalam sel germinal primer jantan. Namun, jika tidak hanya faktor pertumbuhan LIF dan SIF, tetapi juga FGF2 ditambahkan ke dalam medium, sel germinal primer terus berkembang biak, dan koloni sel yang mampu berkembang biak bahkan setelah penghilangan faktor pertumbuhan (SIF dan FGF) dari medium terbentuk dalam subkultur. Sel-sel tersebut dapat dikultur untuk waktu yang lama pada substrat fibroblas embrionik tanpa menambahkan faktor pertumbuhan yang larut LIF. Diusulkan untuk menyebut garis sel stabil ini yang diperoleh dari sel germinal primordial sebagai sel germinal embrionik. Istilah ini sama sekali tidak berhasil, karena tidak mungkin memperoleh sel germinal embrionik yang mampu melakukan tahap oogenesis atau spermatogenesis berikutnya saat membudidayakan sel EG. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa garis sel EG, meskipun berasal dari sel germinal primordial, tetapi, memperoleh sifat-sifat sel induk pluripoten embrionik dalam kultur, kehilangan kemampuan untuk berkomitmen pada garis keturunan germinal. Dengan kata lain, sel germinal primordial, saat dikulturkan, kehilangan sifat-sifat prekursor gamet dan ditransformasikan menjadi sel pluripoten seperti ESC.

Telah diketahui bahwa teratoma tidak muncul ketika sel EG dimasukkan ke tikus yang mengalami defisiensi imun. Diasumsikan bahwa hilangnya kemampuan sel EG manusia untuk menimbulkan teratoma disebabkan oleh fakta bahwa garis keturunan ini tidak dibuat langsung dari sel germinal primer yang dikultur, tetapi diperoleh dari sel yang diisolasi dari badan embrioid. Oleh karena itu, mungkin saja mereka merupakan keturunan sel pluripoten, tetapi sudah berkomitmen.

Perlu dicatat bahwa terdapat perbedaan mendasar antara sel EG dan sel germinal primordial. Sel germinal primordial tidak memungkinkan untuk memperoleh embrio tikus chimeric, yang menunjukkan kurangnya kemampuan sel germinal primordial untuk berintegrasi ke dalam massa sel bagian dalam atau trofektoderm. Karakteristik populasi sel germinal primordial lebih mirip dengan garis sel somatik embrio selanjutnya yang berkomitmen, yang pengenalannya ke dalam blastokista juga tidak mengarah pada pembentukan embrio chimeric.

Modifikasi teknik kultur badan embrioid yang diperoleh melalui agregasi sel EG memungkinkan untuk memperoleh populasi sel pluripoten lain, yang disebut "sel turunan badan embrioid" (sel EBD), menggunakan seleksi pada media selektif. Kemampuan sel EBD untuk berkembang biak dalam kultur dalam waktu lama memungkinkan untuk menciptakan garis sel yang stabil dari sel-sel yang berkomitmen. Klon sel yang mengekspresikan berbagai macam mRNA dan penanda protein sel-sel khusus diperoleh. Pendekatan ini akhirnya membuktikan bahwa sel germinal primer manusia bersifat pluripoten dan berdiferensiasi secara in vitro menjadi berbagai jenis sel: neuron, neuroglia, endotelium vaskular, sel hematopoietik, sel otot dan endodermal.

Sumber alternatif sel induk embrionik

Sumber alternatif untuk galur sel punca sel punca embrionik manusia dapat berupa sel hibrida. Penanaman ke dalam rahim sapi yang sedang hamil semu dari suatu konstruksi heterogen yang diperoleh melalui fusi melalui elektroporasi sel somatik janin manusia dengan sel telur sapi yang pronukleusnya telah dibuang sebelumnya memungkinkan untuk memperoleh massa sel internal dari embrio buatan pada tahap perkembangan pra-implantasi. Untuk tujuan ini, pada tahap pertama blastokista diperoleh dari sel telur sapi dengan inti sel manusia yang ditransplantasikan.

Pada tahap kedua, embrioblas diisolasi dari blastokista, dan dari sana, ESC diisolasi menggunakan metode Thomson. Perlu dicatat bahwa hasil terbaik dalam mengisolasi garis ESC menggunakan metode ini diperoleh dengan menggunakan inti sel folikel atau sel germinal primer yang tetap berada dalam tubuh manusia dalam keadaan hibernasi. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa inti sel manusia yang ditransplantasikan ke dalam telur sapi harus memiliki telomer yang tidak memendek dan aktivitas telomease yang tinggi, yang membantu menghindari penuaan dini klon ESC yang diperoleh dari telur hibrida (Repin, 2001). Diketahui bahwa protein penanda intraseluler ESC yang paling penting adalah Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, yang termasuk dalam apa yang disebut protein peredam kromatin. Peredam menyediakan paket heterokromatin yang sangat padat, yang mencegah pembentukan loop eukromatin. Pengemasan kromatin yang dimediasi oleh protein ini berkorelasi dengan totipotensi genom ESC. Telah ditetapkan hingga saat ini bahwa oosit sapi dan manusia dewasa adalah satu-satunya jenis sel khusus yang mengandung konsentrasi tinggi protein peredam dalam sitoplasma. Atas dasar ini, dikembangkan suatu metode untuk memperoleh sel punca sel induk hibrida dengan mentransfer inti sel somatik ke dalam oosit sapi yang telah dienukleasi. Studi in vitro awal telah menunjukkan bahwa sitoplasma oosit sapi mengembalikan totipotensi genom inti sel somatik manusia setelah 12-24 jam pembudidayaan.

Yang menarik adalah data tentang kekhasan perkembangan praimplantasi embrio manusia, yang menunjukkan penggantian sel totipoten oleh populasi sel pluripoten lebih lambat daripada pada tikus. Sebuah studi tentang transformasi seluler menunjukkan bahwa sel trofoblas juga muncul dari sel-sel massa sel bagian dalam blastokista manusia, selain sel ESC, yang menunjukkan potensi totalnya.

Diketahui bahwa pada tahap blastokista, dua populasi sel yang berkomitmen berbeda muncul. Salah satunya membentuk lapisan luar blastokista - trofektoderm, yang turunannya adalah sel trofoblas dan komponen embrionik plasenta lainnya. Populasi sel kedua dikelompokkan menjadi massa padat yang menyentuh permukaan bagian dalam trofektoderm. Turunan dari populasi sel massa sel bagian dalam adalah semua jaringan dan dasar organ embrio. Pada tahap blastokista akhir, endoderm ekstraembrionik terbentuk dari massa sel bagian dalam dan epiblas (ektoderm primer) terbentuk. Dalam hal ini, sel-sel epiblas mempertahankan pluripotensi, sedangkan kemampuan untuk membedakan sel-sel endoderm ekstraembrionik terbatas.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Memperoleh sel induk embrionik manusia

Hingga saat ini, diyakini bahwa tidak mungkin untuk memperoleh ESC dari trofoblas. Namun, sederet sel induk trofektoderm diploid yang diisolasi dari blastokista berkembang biak dan berubah menjadi sel induk dalam medium yang mengandung FGF2 dan heparin, bukan LIF. Jika FGF2 dikeluarkan dari medium, sel-sel trofektoderm berhenti berkembang biak, endoreduplikasi kromosom dimulai di dalamnya, dan elemen seluler trofektoderm secara bertahap berubah menjadi sel-sel trofoblas raksasa. Mungkin, LIF tidak merangsang proliferasi sel trofektoderm karena fakta bahwa FGF2 memicu mekanisme trans-signaling yang berbeda, karena FGF2, yang mengikat reseptor plasma (FGFR2), mengaktifkan kinase MAP dalam sitoplasma - ERK1 dan ERK2. Akibatnya, ketika satu jalur pensinyalan (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) diaktifkan dalam sel blastokista, sel-sel massa sel bagian dalam diubah menjadi ESC pluripoten, dan ketika mekanisme kedua transduksi sinyal transmembran (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) diaktifkan, sel induk trofektoderm terbentuk dalam blastokista. Pilihan jalur pensinyalan, pada gilirannya, bergantung pada aktivitas gen oct4. Gen ini, yang termasuk dalam domain POU, terletak di lokus t autosom 17 dan diekspresikan selama oogenesis, selama periode pembelahan, serta dalam sel-sel massa sel bagian dalam blastokista dan dalam sel germinal primer. Peran fungsional gen oct4 adalah untuk mengkodekan faktor transkripsi yang diperlukan untuk munculnya sel-sel pluripoten, diferensiasi dan dedifferensiasinya.

Ekspresi gen oct4 dalam sel punca sel punca bervariasi tergantung pada interaksi faktor transkripsi ini dengan kofaktor. Pengaturan terarah ekspresi oct4 dalam blastokista menunjukkan bahwa ketika aktivitasnya berkurang, setengah dari sel membentuk trofektoderm, sedangkan ketika ekspresi oct4 yang diinduksi meningkat, sebagian besar sel punca sel punca muncul.

Dalam percobaan, ESC tidak dapat ditransfer ke dalam garis selama pembudidayaan blastomer totipoten pada tahap pembelahan, serta pada tahap gastrulasi dan tahap perkembangan embrionik selanjutnya. ESC tikus biasanya diisolasi pada hari ke 3,5-4,5 kehamilan, yang sesuai dengan tahap keenam (blastokista satu lapis) dan ketujuh (blastokista dua lapis - silinder telur awal) dari embriogenesis normal. Jelas, hanya pada periode praimplantasi embrio tikus mengandung populasi sel yang mampu bertransformasi menjadi ESC. Akibatnya, isolasi garis ESC hanya mungkin dilakukan pada tahap embriogenesis tertentu. Zigot dan blastomer yang muncul selama pembelahan bersifat totipoten, dari sudut pandang kemungkinan mengembangkan embrio yang layak dengan membran embrionik dan plasenta. Hilangnya potensi total sel germinal dimulai pada tahap morula akhir, ketika komitmen blastomer lebih lanjut bergantung pada lokasinya. Blastomer morula awal mempertahankan totipotensi, karena manipulasi eksperimental dengan perubahan lokalisasi mereka, seperti inversi lokasi mereka, tidak mencegah perkembangan embrio penuh.

Telah ditetapkan bahwa efisiensi mengisolasi sel punca embrionik ke dalam garis sel dipengaruhi oleh kondisi blastokista pada saat eksplantasi. Penggunaan blastokista setelah pemodelan diapause tujuh hari dalam saluran reproduksi tikus yang diovariektomi pada hari ke-3,5 kehamilan dan diberi progesteron memfasilitasi isolasi garis sel punca embrionik yang lebih berhasil. Diasumsikan bahwa dalam kondisi seperti itu jumlah blastomer yang membentuk massa sel bagian dalam meningkat. Ada kemungkinan juga bahwa siklus sel diperpanjang dan sebagian besar blastomer memasuki fase G0.

Selain itu, penciptaan garis sel ESC pluripoten yang stabil bergantung pada genotipe embrio: sel ESC cukup mudah diisolasi dari blastokista garis sel tikus 129, sel ESC jauh lebih sulit diperoleh menggunakan tikus CS7BL/6, dan hampir mustahil untuk mengisolasi garis sel ESC dari blastokista tikus CBA/Ca. Jelas, embrio awal memiliki beberapa fitur genetik yang memengaruhi perkembangan garis sel ESC pluripoten. Meskipun demikian, ketika membudidayakan epiblas yang terisolasi, serta melalui seleksi selektif sel-sel yang berdiferensiasi, garis sel ESC tetap diisolasi dari embrio awal tikus CBA/Ca.

Teknik standar yang terbukti untuk memperoleh garis sel ESC dari blastokista diberikan dalam manual laboratorium tentang teknik percobaan dengan embrio awal. Garis sel ESC eksperimental juga dapat diperoleh dengan membudidayakan epiblast terisolasi (ektoderm primer) dari embrio tikus berusia 4,5 hari menggunakan teknik bedah mikro yang agak rumit dan kondisi pembiakan yang dimodifikasi. Intensitas tenaga kerja dari prosedur ini dibenarkan, karena frekuensi pembentukan garis sel ESC dalam kasus ini ternyata jauh lebih tinggi daripada dalam pekerjaan dengan massa sel bagian dalam blastokista.

Untuk mengisolasi galur ESC, setiap klon dipindahkan ke dalam sumur mikro, agregat 40-60 sel ditumbuhkan, dan kemudian disebarkan lagi. Pengulangan beberapa kali dari prosedur ini memungkinkan kita untuk memperoleh galur ESC yang diabadikan dengan laju proliferasi maksimum sel normokariotipe yang melekat pada plastik, yang mempertahankan totipotensi dan aktivitas telomerase tinggi setelah 50-100 kali pasase. Dalam proses pemeliharaan galur ESC, bahaya terbesar adalah kontaminasi media atau serum dengan endotoksin bakteri - bahkan konsentrasi jejak endotoksin dalam media kultur menyebabkan kematian massal sel germinal yang belum matang. Dengan pemantauan pertumbuhan linier dan dispersi tepat waktu yang cermat, ESC dalam kultur mampu membelah secara simetris, di mana kedua sel anak tetap bersifat pluripoten dan mampu melakukan siklus sel dalam jumlah tak terbatas, mempertahankan kariotipe diploid dan potensi total.

Pemilihan populasi murni sel punca sel punca manusia dapat dilakukan setelah transfeksi genomnya dengan molekul DNA rekombinan yang mengandung gen yang mengkode sintesis protein fluoresensi hijau (GFP). Ekspresi GFP meningkat ketika sel punca sel punca tumbuh dalam kondisi yang mendukung proliferasinya, sedangkan dengan dimulainya diferensiasi, tingkat ekspresi gen ini menurun, yang memungkinkan pemilihan garis sel pluripoten murni dan stabil pada media selektif. Ketika membudidayakan sel punca sel punca yang diisolasi menggunakan seleksi GFP, frekuensi pembentukan koloni meningkat berkali-kali lipat, karena efek antiproliferatif yang kuat dari sel-sel yang berdiferensiasi dihilangkan dalam kondisi kultur seleksi.

Penerjemahan sel punca embrionik manusia menjadi garis keturunan dilakukan dengan menggunakan metode isolasi dari embrio praimplantasi (pada tahap 80-120 sel), yang tersisa setelah prosedur fertilisasi in vitro. Untuk tujuan ini, embrio "berlebih" yang diperoleh secara artifisial disebarkan secara mekanis dalam medium Delbecco-Eagle. Setelah memberi label sel dengan antibodi monoklonal selektif dengan label fluoresensi, sel embrioblas diisolasi. Embriblas disebarkan ke dalam sel-sel individual menggunakan campuran dispase-kolagenase. Sel-sel yang terdisosiasi ditumbuhkan dalam medium khusus (80% medium Delbecco + 20% serum anak sapi janin dengan adanya 500 μg/ml IL-6, LIF dan SCF) di atas lapisan tunggal fibroblas embrionik dari 3 bagian pertama. Dalam hal ini, kelangsungan hidup dan proliferasi sel punca dan sel progenitor dipertahankan karena efek IL-6, LIF dan SCF. Dalam media tersebut, ESC tumbuh sebagai klon suspensi dari sel-sel yang menggumpal dan tidak menempel, yang harus dipisahkan dengan pipet yang lembut dan berulang. Klon baru muncul dalam kultur yang tersuspensi pada hari ke-5-7. Laju pertumbuhan maksimum ESC dicapai dengan disosiasi klon berulang pada tahap 10-15 sel. Kemudian, setiap klon dipindahkan ke sumur mikro dan tumbuh menjadi agregat 40-50 sel. Prosedur ini diulang berkali-kali dalam lintasan, meningkatkan volume kultur hingga kepadatan 5-10 juta sel per cawan berukuran 6 cm. Dengan menggunakan lintasan tersebut, Thomson mengisolasi 10 klon abadi ESC manusia, yang setelah 100 lintasan mempertahankan aktivitas telomerase yang tinggi, kemampuan untuk berkembang biak dengan kuat, karakteristik fenotipik minimal, dan potensi total dengan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi salah satu dari 350 garis sel khusus yang berasal dari ekto-, meso-, dan endoderm. Diferensiasi sel ESC manusia dimulai (setelah perubahan medium, penambahan serum, dan eliminasi LIF) dengan perlekatan sel ke substrat, yang menunjukkan perkembangan sitoskeleton dan ekspresi reseptor adhesi. Yang penting, dengan proliferasi tak terbatas, sel ESC manusia mempertahankan kariotipe normal.

Metode kedua untuk mengisolasi garis sel ESC manusia didasarkan pada penggunaan sel germinal primer. Studi eksperimental telah menunjukkan bahwa garis sel E dapat diperoleh dari lipatan genital embrio tikus berusia 12,5 hari. Namun, dalam kasus ini frekuensi pembentukan garis sel progenitor secara signifikan lebih rendah daripada dalam percobaan dengan embrio sebelumnya. Pada saat yang sama, sel germinal primer dari gonad embrio tikus usia kehamilan 13,5 hari tidak mampu berubah menjadi garis sama sekali.

Garis stabil pertama sel EG manusia pluripoten diperoleh dari gonosit primer yang diisolasi dari gonad embrio berusia 5-9 minggu. Sel yang diisolasi dikultur pada substrat fibroblas embrionik tikus yang diinaktivasi dalam medium DMEM dengan serum janin yang disuplemen dengan merkaptoetanol, forskolin, dan faktor pertumbuhan manusia rekombinan (FGF dan LIF). Setelah 7-12 hari, koloni multiseluler muncul dalam kultur, yang sesuai dengan sel EG manusia berdasarkan ciri morfologi dan penanda molekuler. Setelah agregasi, sel-sel ini membentuk badan embrioid, dengan perkembangan lebih lanjut yang mana sel-sel khusus yang menjadi ciri turunan dari ketiga lapisan germinal muncul. Selama 10-20 kali pelintasan, garis sel EG mempertahankan kariotipe normal dan tidak kehilangan pluripotensi.

Telah ditunjukkan pula bahwa aksi gabungan LIF, faktor Steel yang terikat membran dan larut, serta TGF-b mengubah program perkembangan sel germinal primordial. Alih-alih menghentikan pembelahan mitosis dan mulai berdiferensiasi menuju oogenesis atau spermatogenesis, sel germinal primordial terus berkembang biak. Setelah beberapa siklus mitosis tambahan, mereka menjadi mirip dengan sel epiblas dan, kehilangan sifat prekursor sel germinal, ditransformasikan menjadi sel induk embrionik pluripoten EG.

Dengan demikian, pada tahun 1998, garis sel germinal primordial yang diabadikan diisolasi untuk pertama kalinya dari rudimen genital jaringan otopsi janin manusia. Dalam embriogenesis manusia, sel germinal primordial muncul di kantung kuning telur pada minggu ke-3 perkembangan, dan pada minggu ke-4 hingga ke-5, sel-sel ini bermigrasi ke zona tuberkel genital, tempat mereka membentuk populasi gonosit primer yang tidak aktif. Dalam keadaan tidak aktif, sel germinal primordial diawetkan dalam embrio hingga lahir. Garis sel germinal primordial diisolasi dari tuberkel genital janin embrio berusia 5-9 minggu, yang jaringan yang diekstraksi diperlakukan secara ex tempore dengan campuran kolagenase tipe IV-V, hialuronidase, dan DNase untuk meningkatkan hasil sel secara kuantitatif dan kualitatif. Sel germinal primordial dalam jaringan tuberkel genital janin dikelilingi oleh sel Sertoli stroma (mesenkimal). Tujuan fungsional sel Sertoli adalah untuk menghasilkan faktor antiapoptotik (ligan Fas), mitogen, dan imunosupresan yang melindungi sel germinal dari serangan imun oleh tubuh. Selain itu, lingkungan mikro stroma tuberkulum genital berperan penting dalam pematangan gamet. Sel germinal primer yang diisolasi ditanam dalam kultur di atas lapisan stroma pengumpan yang terdiri dari fibroblas janin dari tiga bagian pertama. Kombinasi mitogen yang paling efektif adalah kompleks yang terdiri dari LIF, FGF, dan forskolin (stimulator pembentukan cAMP). Proliferasi sel germinal primer secara in vitro memerlukan penambahan serum janin, yang mana reproduksi gonosit primer dalam kultur disertai dengan pembentukan klon sel bulat yang tidak melekat pada substrat.

Di National Institutes of Health, AS, berdasarkan ringkasan data yang ada tentang metode untuk mengisolasi garis sel ESC manusia dari blastokista, kesimpulan awal dibuat bahwa isolasi sel ESC yang berhasil kemungkinan besar terjadi saat membudidayakan blastokista dengan massa sel bagian dalam yang terbentuk dengan baik (Sel induk: kemajuan ilmiah dan arah penelitian masa depan. Nat. Inst, Kesehatan AS). Dari sudut pandang ini, sumber sel ESC yang optimal untuk membuat garis sel adalah blastokista manusia pada hari ke-5 perkembangan, yang darinya trofektoderm harus dihilangkan dengan hati-hati saat mengisolasi massa sel bagian dalam. Massa sel bagian dalam yang terisolasi, yang terdiri dari 30-35 sel pada tahap ini, harus dikulturkan pada substrat fibroblas embrio tikus, yang merupakan kondisi yang menentukan untuk pembentukan koloni sel ESC dalam kultur.

Analisis fitur fenotipik sel induk embrionik

Yang menarik adalah analisis perbandingan antarspesies dari ciri-ciri fenotipik sel punca embrionik. Ditemukan bahwa koloni sel punca embrionik manusia adalah kelompok padat sel pipih seperti epitel, sedangkan badan embrio tikus terdiri dari konglomerat longgar sel bulat. Pada sel punca embrionik manusia, indeks rasio inti-plasma lebih rendah daripada pada sel punca embrionik tikus. Sel punca embrionik monyet membentuk koloni sel pipih dengan tepi tidak rata. Sel-sel individual mudah terlihat pada klon awal sel punca embrionik primata. Sel punca embrionik yang berproliferasi dari semua spesies hewan yang diteliti tidak mengekspresikan molekul MHC kelas I dan II. Pada saat yang sama, sel punca embrionik manusia memberikan reaksi positif terhadap antibodi TERA 1-60 dan GCTM-2, yang menunjukkan adanya proteoglikan keratin/kondroitin sulfat pada permukaannya, yang merupakan karakteristik sel punca embrio-(terato)-karsinoma. Ekspresi gen oct4 dalam sel ESC semua spesies hewan menunjukkan bahwa, meskipun terdapat perbedaan fenotip, rangkaian gen yang sama yang bertanggung jawab untuk mempertahankan pluripotensi tampaknya diaktifkan dalam sel ESC manusia dan tikus (Peru, 2001). Selain itu, galur sel ESC yang diisolasi dari embrio tikus, babi, kelinci, primata, dan sapi memiliki karakteristik morfologi yang serupa, rangkaian penanda identifikasi molekuler yang serupa, dan mekanisme molekuler yang hampir identik untuk menerapkan program embriogenesis, yang memungkinkan kita untuk melihat masalah xenotransplantasi dengan cara baru.

Tidak seperti embriogenesis normal in vivo, proliferasi ESC in vitro tidak disertai dengan pembentukan lapisan germinal dan terjadi dengan latar belakang pemblokiran gen Hox homeotik, yaitu, tanpa organogenesis. Karena gen segmentasi tidak berfungsi, tidak mungkin untuk mereproduksi periode embriogenesis seperti peletakan somite, segmentasi embrio, pembentukan kantung kuning telur, allantois dan organ serta jaringan sementara lainnya dalam kultur ESC. ESC yang dikultur tampaknya telah membeku pada awal proses pembentukan 350 garis restriksi sel-sel khusus. Dengan demikian, klon sel progenitor anak dan ESC yang terlokalisasi secara sentral hanya mewakili model embrio, selama perkembangan di mana garis sel khusus yang berbeda secara bersamaan terbentuk di daerah jaringan yang berbeda, yang, bagaimanapun, berasal dari prekursor umum. Meskipun tingkat reseptor pada permukaan sel punca embrionik sangat minim, sel punca embrionik tetap memiliki kemampuan untuk menjalankan proses morfogenetik primitif, meniru struktur volumetrik embrio awal: suspensi sel punca embrionik dalam kultur agregat dan membentuk struktur yang menyerupai blastokista atau bahkan embrio selanjutnya (silinder telur). Agregat suspensi tersebut masing-masing disebut badan embrioid sederhana dan kompleks.

Dalam diferensiasi campuran, gen awal ektoderm (oct3, fgf-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), mesoderm kardiogenik (pkh-2.5), tabung saraf (msx3) dan hematopoiesis (elkf) diekspresikan secara bersamaan dalam sel-sel yang berbeda dari satu badan embrioid. Dengan menggunakan berbagai kombinasi faktor pertumbuhan dan sitokin untuk tindakan yang ditargetkan pada pembentukan sel-sel lapisan germinal secara in vitro, dalam sejumlah kasus dimungkinkan untuk memperoleh badan embrioid di mana gen ektoderm atau mesoderm diekspresikan secara istimewa, yang membuka jalan bagi pemodelan gastrulasi dan fase awal organogenesis.

Pertumbuhan klonal sel punca embrional merupakan bukti adanya pembelahan sel asimetris, di mana hanya satu sel punca embrional di bagian tengah klon yang mempertahankan potensi proliferasi tanpa batas, sementara sel anak kedua menghasilkan generasi sel progenitor yang sudah mengalami diferensiasi. Oleh karena itu, laju proliferasi klon di bagian tepi badan embrional lebih tinggi daripada di bagian tengah. Sel-sel marginal dari klon yang sedang tumbuh mengalami diferensiasi spontan yang tidak teratur, bermigrasi, atau mati melalui mekanisme apoptosis. Peristiwa-peristiwa ini menentukan nasib klon: jika laju proliferasi melebihi laju migrasi dan kematian sel apoptosis, klon terus bertambah besar, stabilisasi terjadi ketika laju apoptosis dan laju pembentukan sel baru sama, dan regresi terjadi ketika rasio dari proses-proses ini berbanding terbalik. Sel progenitor membelah secara simetris, yaitu, kedua sel anak kemudian berdiferensiasi menjadi garis sel khusus yang matang. Rasio sel punca embrional terhadap sel progenitor bervariasi, tetapi jumlah sel punca embrional selalu hanya sebagian kecil dari satu persen populasi sel progenitor. Oleh karena itu, hanya pemipetan yang cermat dan disagregasi klon yang tepat waktu yang dapat meningkatkan jumlah ESC dalam kultur. Disagregasi klon pada tahap 10-12 sel ternyata paling efektif untuk mendapatkan hasil ESC yang maksimal. Arah dan derajat diferensiasi sel dalam tubuh embrioid bergantung pada lokasinya. Sel-sel luar tubuh embrioid tidak mengekspresikan gen oct4 dan mengalami diferensiasi menjadi sel-sel endoderm primer, yang darinya sel-sel mirip epitel endoderm ekstraembrionik parietal dan viseral kemudian terbentuk. Sel-sel dalam tubuh embrioid mengekspresikan gen oct4 dan mempertahankan pluripotensi selama 48 jam kultivasi. Namun, kultur kemudian direstrukturisasi secara morfologis menjadi lapisan tunggal epitel dan ekspresi gen yang mengendalikan perkembangan ektoderm primer dimulai. Selanjutnya, proses sitodiferensiasi total yang tidak teratur dimulai dengan munculnya berbagai jenis sel yang merupakan turunan dari ketiga lapisan germinal. Dalam proses diferensiasi spontan sel-sel tubuh embrioid, agregat dengan penanda endoderm dalam bentuk fragmen (kista) kantung kuning telur adalah yang pertama kali muncul. Kemudian, angioblas dan sel-sel endotel kapiler yang tumbuh muncul dalam struktur ini. Pada tahap akhir diferensiasi spontan, berbagai sel yang berdiferensiasi secara terminal berkembang dari sel-sel internal tubuh embrioid, termasuk neuron, elemen glia, kardiomiosit, makrofag, dan eritrosit. Sampai batas tertentu (dengan mempertimbangkan inversi spasial pembentukan lapisan jaringan germinal), menggunakan tubuh embrioid, adalah mungkin untuk mempelajari proses morfogenetik secara in vitro dan menganalisis mekanisme molekuler dari periode awal sitodiferensiasi embrionik,serta untuk menetapkan peran gen spesifik dalam penerapan proses ini.

Dengan demikian, di dalam klon terdapat sel-sel yang di dalamnya ditemukan program-program perkembangan genetik yang berbeda - sel-sel endotel vaskular, sel-sel progenitor awal, dan populasi-populasi progenitor yang berdiferensiasi. Budidaya sel-sel endotel vaskular dengan metode tetes gantung atau kultur massa tanpa lapisan pengumpan dan tanpa penambahan LIF ke dalam medium pasti mengarah pada pembentukan badan-badan embrioid. Morfologi sel-sel lapisan luar dan dalam badan-badan embrioid berbeda. Lapisan luar terdiri dari sel-sel besar yang bercabang. Permukaannya yang menghadap ke lingkungan ditutupi oleh banyak mikrovili. Lapisan luar sel dipisahkan dari lapisan dalam oleh membran basal yang menyerupai membran Reichert, sedangkan sel-sel lapisan dalam badan-badan embrioid adalah epitel kolumnar. Secara morfologi, lapisan dalam, meskipun mengandung banyak sel yang membelah, lebih mirip dengan koloni-koloni sel-sel endotel vaskular yang tidak berdiferensiasi.

Karakteristik sel induk embrionik manusia

Tidak adanya interaksi sinyal parenkim-mesenkimal dengan latar belakang pemblokiran gen homeosis menyebabkan pertumbuhan sel punca sel punca yang tidak teratur dalam kultur, karena hal ini mengganggu pembentukan dan perkembangan infrastruktur organ sementara. Pertumbuhan yang tidak teratur dan diferensiasi spontan sel punca sel punca yang tidak teratur dalam kultur disebabkan oleh tidak adanya penandaan mesenkimal pada kerangka stroma organ masa depan: secara in vitro, sangat mungkin untuk membentuk jutaan hepatosit, tetapi tidak mungkin untuk memperoleh satu lobulus hati yang mencakup elemen struktural dan fungsional seperti sinus, ruang Disse, dan sel Kupffer.

Dipercayai bahwa pluripotensi ESC terwujud secara eksklusif dalam embriogenesis dengan pembentukan jaringan dan organ embrio, sedangkan plasenta dan tali pusat merupakan turunan dari trofoblas. ESC yang tertutup dalam membran trofektodermal secara berurutan menghasilkan klon sel sementara yang melaksanakan program pengembangan melalui mRNA kombinatorial dari matriks topografi volumetrik Nokhteyov, yang menentukan susunan spasial, bentuk dan ukuran, jumlah sel organ sementara dan definitif, serta perakitan parenkim menjadi unit struktural dan fungsional. Pada saat yang sama, ESC tetap menjadi satu-satunya jenis sel di mana mekanisme molekuler untuk pelaksanaan potensinya sepenuhnya terputus dari program pengembangan genetik, dan ESC sendiri kehilangan kemampuan untuk berinteraksi dengan sel lain karena pemblokiran persepsi reseptor dan sistem transsignaling. Namun, aktivasi ESC yang memadai mengarah pada pengembangan program embriogenesis selangkah demi selangkah, yang berakhir dengan kelahiran organisme yang terbentuk sepenuhnya, yang terdiri dari miliaran sel, yang siap untuk kehidupan ekstrauterin. Pada jalur jangka pendek tetapi tak terbayangkan jangka panjang di ruang seluler ini, kesalahan pasti muncul baik dalam mekanisme molekuler yang memastikan aktivitas vital sel maupun dalam program yang mengendalikan proliferasi, diferensiasi, dan spesialisasinya. Oleh karena itu, dalam farmakogenomik modern, penyakit pada struktur molekuler dan penyakit pemrograman sel dipertimbangkan secara terpisah. Selain itu, tindakan sebagian besar obat baru ditujukan untuk memperbaiki program diferensiasi, proliferasi, dan organogenesis, serta regenerasi organ dan jaringan. Pada organisme dewasa, ESC memungkinkan untuk mengendalikan perilaku sel induk/progenitor yang ditransplantasikan ke otak, hati, limpa, sumsum tulang, dan organ manusia lainnya untuk memulihkan parenkim organ penerima yang rusak dengan membedakan dan mengkhususkan sel donor pada matriks mesenkim yang diawetkan. Pada hakikatnya, program totipotensi mulai terwujud pada tingkat genom oosit, zigot, dan blastomer; namun, sel-sel ini belum dikloning dan diwariskan dalam jumlah yang diperlukan untuk kebutuhan pengobatan eksperimental dan praktis. Oleh karena itu, sel punca embrionik tetap menjadi sumber informasi genetik yang unik yang berisi kode untuk peta tiga dimensi embrio dan kode untuk pembatasan linier garis sel khusus selama gastrulasi.

Potensi regeneratif sel punca sel punca yang hampir tak terbatas disebabkan oleh fakta bahwa genomnya, tidak seperti aparatus genetik sel somatik yang berdiferensiasi, mempertahankan pluripotensi. Salah satu manifestasi dari keadaan dorman informasi genetik yang tertanam dalam sel punca sel punca adalah apa yang disebut fenotipe minimal - sejumlah reseptor terbatas diekspresikan pada permukaan sel punca sel punca, dan, karenanya, sangat sedikit program trans-signaling yang digunakan untuk interaksi aparatus nukleus sel dengan lingkungan mikronya. Dengan latar belakang hibernasi gen yang bertanggung jawab atas pembatasan garis sel khusus dan diferensiasi sel, hanya sekitar 30 dari 500 gen yang diaktifkan, yang produknya memastikan hubungan sel dengan lingkungan mikro di sekitarnya. Dengan menggunakan metode analisis serial ekspresi gen, ditunjukkan bahwa dengan kerja umum kotak fungsional utama genom yang mengatur energetika dan metabolisme dalam sel somatik dan ESC, yang terakhir memiliki tingkat mRNA reseptor, protein G, pembawa pesan sekunder, transkriptase, kofaktor ekspresi dan represi yang sangat rendah, yaitu, seluruh sistem transmisi transmembran sinyal pengatur ke sel. Hal ini disebabkan oleh tidak adanya atau ekspresi gen transsignaling yang sangat rendah. Selama periode diferensiasi yang diinduksi dalam genom ESC, 18 gen yang berfungsi secara serempak berhenti bekerja dengan latar belakang aktivasi 61 gen transsignaling yang mengendalikan sintesis reseptor adhesi sel, komponen matriks ekstraseluler, transkriptase restriksi, dan elemen pembawa pesan dari sistem transmisi sinyal ke aparatus nuklir dari reseptor membran plasma sel. Pada saat yang sama, ekspresi gen yang bertanggung jawab untuk sintesis protein peredam diblokir, serta ko-inhibitor ekspresi gen yang memastikan totipotensi genom ESC.

Penanda gen telah ditemukan untuk sel-sel dari ketiga lapisan germinal. Identifikasi lapisan sel ektodermal dilakukan dengan ekspresi gen nodal, oct3 dan fgf-5, sel-sel mesoderm - oleh gen brachyuri, zeta-globin, endoderm - dengan ekspresi gen gata-4. Dalam embriogenesis normal selama periode gastrulasi, migrasi aktif populasi sel induk dan sel progenitor yang belum matang diamati, secara lokal menandai zona perkembangan tulang wajah tengkorak, beberapa bagian otak, sistem saraf tepi, sistem konduksi jantung dan timus, yang jaringannya terbentuk dari klon sel migran. Penandaan sel oleh gen awal lapisan germinal memfasilitasi tugas analisis topografi proses migrasi sel prekursor dalam embrio yang sedang berkembang. Telah ditetapkan, khususnya, bahwa dalam agregat sel embriokarsinoma P19, ekspresi gen mesoderm pertama brachyuri dimulai selama periode penurunan ekspresi gen aktivator plasminogen jaringan, a-fetoprotein, keratin 8 dan keratin 19, yang merupakan penanda populasi mesoderm pertama yang bermigrasi. Akibatnya, pembentukan jaringan asal mesodermal dimulai hanya setelah selesainya proses migrasi titik dan penyebaran sel progenitor mesodermal.

Meskipun fitur fenotipiknya sangat terbatas dan tidak adanya sebagian besar unit trans-signaling, ESC masih mengekspresikan beberapa molekul reseptor yang dapat digunakan untuk identifikasinya. Perlu dicatat bahwa antigen penanda ESC pada manusia dan primata ternyata umum. Paling sering, antibodi berlabel untuk antigen terikat membran SSEA-3, SSEA-4 (antigen lipid unik yang mewakili kompleks glikolipid GL7 dengan asam sialik), serta glikoprotein polimer tinggi TRA-1-81, TRA-1-60 digunakan untuk pelabelan ESC. Selain itu, ESC mengekspresikan antigen embrionik spesifik SSEA-1 dan alkali fosfatase endogen, serta faktor transkripsi spesifik Oct4. Yang terakhir diperlukan untuk mempertahankan mekanisme proliferasi ESC - faktor transkripsi spesifik Oct4 mengaktifkan ekspresi gen faktor pertumbuhan fibroblast 4 dan menstabilkan ekspresi kotak gen yang bertanggung jawab untuk replikasi DNA tak terbatas pada sel yang belum matang. Protein penanda intraseluler yang paling penting adalah Oct3, Oct4, Tcf dan Groucho, yang terkait dengan protein peredam kromatin.

Hampir segera setelah bertahun-tahun upaya untuk membudidayakan ESC di luar tubuh berhasil dan kultur pertama sel punca yang diisolasi dari blastokista tikus dan kultur sel germinal primer diperoleh, tahap penelitian tentang potensi pluripoten ESC dimulai ketika mereka diperkenalkan ke embrio pada tahap awal perkembangan. Ditunjukkan bahwa pada tahap morula dan blastokista, ESC mampu membentuk embrio chimeric di mana keturunan ESC donor terdeteksi di semua jaringan somatik dan bahkan di gamet. Dengan demikian, dalam biologi perkembangan, menggunakan ESC, "jembatan" dibangun antara studi eksperimental in vivo dan in vitro, yang secara signifikan memperluas kemungkinan untuk mempelajari proses peletakan jaringan dan organ primer, diferensiasi dan organogenesis embrioniknya.

Telah ditetapkan dengan jelas bahwa in vivo selama embriogenesis, ESC diintegrasikan ke dalam massa sel embrio awal, dan turunannya ditemukan di semua organ dan jaringan. ESC menjajah garis sel germinal dalam embrio chimeric, yang keturunannya membentuk sel telur dan sperma yang lengkap. Sel induk embrionik bersifat klonogenik - satu ESC mampu menciptakan koloni sel yang identik secara genetik dengan penanda molekuler, yang meliputi ekspresi gen oct4 dan alkali fosfatase, aktivitas telomerase tinggi, dan ekspresi antigen embrionik tertentu.

Untuk mempelajari mekanisme embriogenesis menggunakan sel punca embrionik, metode kimerisasi morula telah dikembangkan dengan menciptakan konstruksi biologis, yang di luarnya terdapat lapisan blastomer tetraploid penerima, dan sel punca embrionik donor dimasukkan ke dalam. Dengan demikian, trofoblas terbentuk dari keturunan blastomer tetraploid penerima, yang memastikan implantasi dan plasentasi, dan sel punca embrionik donor bertindak sebagai massa sel internal tempat tubuh embrio yang layak dan garis sel germinal progenitor primer terbentuk. Nilai penelitian sel punca embrionik tidak hanya terletak pada fakta bahwa pluripotensi dipertahankan selama manipulasi in vitro dengan genomnya, tetapi juga pada fakta bahwa kemampuan sel punca embrionik untuk berpartisipasi dalam pembentukan sel germinal primer embrio kimerik dipertahankan. Telah ditunjukkan bahwa keturunan dari satu sel punca embrionik yang dimodifikasi secara genetik mengisi semua rudimen primer dan jaringan yang sedang berkembang dari embrio kimerik yang diperoleh melalui agregasi atau kokultivasi sel ini dengan embrio 8 sel. Ketika sel ESC yang ditransfeksi dengan gen protein fluoresens hijau ditransplantasikan ke morula tikus, keturunan fluoresens dari sel ini ditemukan di semua jaringan embrio yang sedang berkembang yang diteliti (Shimada, 1999). Transplantasi sel ESC ke morula memungkinkan terciptanya tikus yang hidup yang organismenya hanya terdiri dari keturunan sel ESC donor, yang membuka prospek untuk berbagai pilihan kloning terapeutik. Pendekatan metodologis ini sekarang berhasil digunakan untuk mempelajari masalah-masalah biologi perkembangan, khususnya, digunakan untuk menganalisis mekanisme inaktivasi genetik kromosom X atau ketidakstabilan epigenetik sel ESC. Transplantasi sel ESC ke embrio awal juga digunakan dalam bioteknologi pertanian, serta dalam eksperimen terapi gen.

Transplantasi sel induk ESC yang dimodifikasi secara genetik digunakan untuk menguji sel target dari gen mutan. Sel induk ESC yang dikultur secara in vitro digunakan dalam bioteknologi untuk menciptakan tikus knockout. Untuk tujuan ini, gen yang akan dipelajari dikeluarkan dari sel induk ESC melalui rekombinasi homolog (knockout) dan sel yang tidak memiliki gen ini diisolasi pada media selektif. Sel induk ESC knockout kemudian dimasukkan ke dalam blastokista atau diagregasi dengan blastomer morula. Embrio awal chimeric yang diperoleh dengan cara ini ditransplantasikan ke betina penerima, dan individu dengan gamet nullizigot untuk gen tertentu dipilih dari antara tikus yang baru lahir. Teknologi ini telah digunakan untuk menciptakan banyak galur tikus knockout, yang banyak digunakan dalam biologi eksperimental dan kedokteran eksperimental. Model biologis tersebut digunakan untuk mempelajari signifikansi gen tertentu dalam perkembangan embrio, serta perannya dalam mekanisme penyakit manusia dan kondisi patologis. Selain itu, galur hewan knockout digunakan dalam pengujian praklinis metode terapi gen baru. Misalnya, dengan mentransfeksi alel normal gen mutan ke genom ESC, adalah mungkin untuk secara efektif mengoreksi mutasi yang mempengaruhi sistem hematopoietik. Pengenalan gen asing ke dalam ESC memungkinkan penciptaan garis hewan laboratorium transgenik homozigot yang cepat. Namun, perlu dicatat bahwa teknik penghapusan gen rekombinasi yang ditargetkan sejauh ini hanya dikembangkan secara andal dalam kaitannya dengan ESC tikus. Dengan menggunakan ESC tikus knockout ganda, peran fungsional wilayah kluster gen pada kromosom 7 (salinan wilayah genomik pada kromosom manusia 19) dan wilayah proksimal kromosom 11 (salinan kromosom manusia 5g) ditetapkan - penghapusan gen-gen ini dalam ESC tikus memungkinkan untuk mengevaluasi fungsi analog mereka pada manusia.

Kemungkinan untuk mempelajari fungsi gen embriogenesis manusia telah berkembang, transfeksi yang ke dalam genom ESC hewan laboratorium telah memungkinkan, khususnya, untuk mengklarifikasi peran gen kripto dalam pembentukan dan perkembangan mesoderm kardiogenik, gen pax-6 - dalam embriogenesis mata. Peta pertama ekspresi gen dalam ESC proliferasi yang belum matang dari teratokarsinoma dan blastokista tikus sedang disusun, dan represi supresif gen transsignaling dalam ESC telah dikonfirmasi. Kombinasi 60-80 ESC mutan dan 20-30 sel embrio tikus praimplantasi normal mengarah pada pengembangan embrio chimeric di mana primordia organ terdiri dari sel donor dan penerima, yang memungkinkan untuk mengklarifikasi peran gen yang tidak diketahui dalam gastrulasi dan organogenesis. Peta fungsional gen embrio tikus yang sedang berkembang dilengkapi dengan informasi tentang peran gen sf-1 dalam pembentukan kelenjar adrenal dan gonad, gen wt-1 dalam pembentukan ginjal, gen keluarga myoD dalam pembentukan otot rangka, dan gen keluarga gata-1-4 dalam pematangan restriksi dasar eritropoiesis dan limfopoiesis.

Pengalihan terarah alel maternal dan paternal gen dalam sel punca embrional menggunakan vektor rekombinase memungkinkan untuk memperjelas fungsi berbagai gen pada periode awal embriogenesis, dan teknologi transfer terarah gen manusia yang tidak diketahui ke dalam sel punca embrional tikus berkontribusi pada penemuan gen mutan baru yang bertanggung jawab atas perkembangan patologi herediter yang parah. Dengan menggunakan metode knockout, signifikansi wajib beberapa gen untuk pembentukan jaringan embrional ditentukan: gata-4 - untuk miokardium, gata-1 - untuk garis keturunan eritroid jaringan hematopoietik, myoD - untuk otot rangka, brachyuri - untuk mesoderm, transkriptase restriksi hnf3 dan hnf4 - untuk sel punca hati, rag-2 - untuk pembentukan klon limfosit T dan B (Repin, 2001). Penghapusan ganda gen dalam sel punca embrionik telah membuka akses untuk mempelajari peran fungsional gen lapisan germinal, segmentasi dan homeosis, dan transplantasi sel punca embrionik telah memungkinkan untuk memperoleh embrio hibrida antarspesies yang layak. Dengan menggunakan teknik yang lebih baik untuk mentransplantasikan sel punca embrionik donor tunggal ke dalam embrio 8 sel, fakta adanya kimerisasi pada tingkat seluler dari banyak organ embrio penerima telah dibuktikan. Perlu dicatat bahwa tunas sel jaringan manusia telah ditemukan di organ tikus penerima setelah pengenalan sel punca hematopoietik manusia ke dalam blastokista. Telah ditetapkan bahwa sel punca embrionik pluripoten beredar dalam darah embrio tikus selama periode pembentukan organ. Ada kemungkinan bahwa fungsi biologisnya terletak pada organisasi embrionik sistem imun masa depan. Dengan bantuan ESC, model patologi genetik manusia yang memadai telah direproduksi dalam kondisi laboratorium: penghapusan ganda gen distrofin memodelkan distrofi otot Duchenne pada tikus, dan penghentian gen atm (kontrol sintesis kinase sinyal kromatin) - ataksia-telangektasia. Pada penyakit keturunan yang fatal pada anak-anak ini, degenerasi sel Purkinje di otak kecil berkembang karena cacat pada perbaikan DNA, yang disertai dengan involusi timus karena kematian sel yang berkembang biak. Gambaran klinis, patofisiologi dan patomorfologi ataksia-telangektasia, yang direproduksi dengan memasukkan informasi genetik patologis ke dalam ESC, pada tikus chimera sesuai dengan yang ada pada manusia. Selain ataksia-telangektasia, menggunakan ESC dan tikus knockout, model eksperimental beberapa penyakit manusia homozigot herediter yang terkait dengan patologi metabolisme karbohidrat dan lipid, katabolisme asam amino, dan ekskresi tembaga dan bilirubin telah dikembangkan, yang telah secara signifikan memperluas kemampuan pengobatan eksperimental pada tahap pengujian praklinis metode baru untuk mengobati penyakit manusia terkait.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Penggunaan sitohibrid sel induk

Sel hibrida yang diperoleh dengan menggabungkan sel punca sel induk dengan sel somatik merupakan model yang memadai dan menjanjikan untuk mempelajari pluripotensi sel induk dan memprogram ulang kromosom sel yang berdiferensiasi. Sitohibrida yang diperoleh dengan menggabungkan sel punca sel induk dengan sel hewan dewasa yang berdiferensiasi memungkinkan untuk mempelajari hubungan antara genom dari "usia" yang berbeda: situasi unik muncul ketika kromosom homolog yang berasal dari sel pada tahap diferensiasi yang berbeda dan tingkat kematangan yang berbeda terletak di nukleus yang sama, di mana mereka dapat dengan mudah bertukar sinyal regulasi trans-akting. Sulit untuk memprediksi bagaimana sistem epigenetik cisregulatori kromosom homolog, yang terbentuk selama perkembangan individu, akan bereaksi terhadap pengaruh sinyal trans-akting yang berasal dari genom terkait embrionik. Selain itu, segregasi kromosom induk terjadi pada sel hibrida, yang memungkinkan kita untuk mempelajari interaksi genom pada tingkat kromosom individu, yaitu, untuk berpotensi mengidentifikasi partisipasi kromosom spesifik dalam mempertahankan pluripotensi atau, sebaliknya, keluar menuju diferensiasi.

Sitohibrid yang diperoleh dengan menggabungkan teratokarsinoma pluripoten dan sel somatik yang berdiferensiasi digunakan sebagai model eksperimental pertama untuk mempelajari interaksi genom dengan "riwayat perkembangan" yang berbeda. Dalam beberapa kasus, sel hibrida tersebut mempertahankan sifat pluripoten pada tingkat yang cukup tinggi. Secara khusus, sel hibrida teratokarsinoma-somatik in vivo menginduksi perkembangan teratoma sejati yang mengandung turunan dari ketiga lapisan germinal, dan in vitro dalam kultur suspensi mereka membentuk badan embrioid. Bahkan dalam sitohibrid interspesifik jenis ini, keberadaan antigen embrionik dicatat dalam kasus-kasus di mana mitra somatik dalam fusi dengan sel teratokarsinoma adalah limfosit atau timosit. Perlu dicatat bahwa sitohibrid yang dibuat dengan menggabungkan sel teratokarsinoma dengan fibroblas sesuai dengan fibroblas dalam fenotipe.

Fakta terpenting yang telah ditetapkan adalah bahwa pada sel hibrida teratokarsinoma-somatik, tanda-tanda pemrograman ulang genom sel yang terdiferensiasi muncul, yang ditandai dengan pengaktifan kembali gen individu atau kromosom X yang tidak aktif dari pasangan somatik. Dengan demikian, hasil penelitian pada sitohibrid dari jenis sel teratokarsinoma-somatik menunjukkan bahwa pluripotensi sering dipertahankan dalam sel hibrida dan ada tanda-tanda pemrograman ulang genom pasangan somatik.

Dalam percobaan untuk memperoleh sel hibrida embrionik intraspesifik dengan menggabungkan sel ESC tikus dengan sel limpa dewasa, karakteristik sitohibrid tersebut dipelajari, segregasi kromosom induk dianalisis, dan pluripotensi genom hibrida dinilai. Sel hibrida intraspesifik yang diperoleh dengan menggabungkan sel teratokarsinoma dengan sel somatik biasanya dicirikan oleh tingkat segregasi kromosom yang rendah dengan kariotipe tetraploid atau hampir tetraploid. Komposisi kromosom yang serupa diamati dalam sitohibrid selama penggabungan sel germinal primer dengan limfosit. Pada saat yang sama, sel hibrida interspesifik yang diperoleh dengan menggabungkan sel teratokarsinoma tikus dengan limfosit cerpelai menunjukkan segregasi kromosom yang intens dari pasangan somatik.

Tahap kualitatif baru dalam studi segregasi kromosom parental pada hibrida intraspesifik dimulai setelah pengembangan metode untuk menganalisis mikrosatelit menggunakan reaksi berantai polimerase, berkat ditemukannya beberapa ratus penanda untuk setiap kromosom tikus, yang memungkinkan diskriminasi yang andal terhadap setiap pasangan kromosom homolog dalam sel hibrida.

Dengan menggabungkan ESC (sel HM-1 yang kekurangan aktivitas hipoksantin fosforibosiltransferase, 2n = 40, XY, yang diisolasi dari blastokista tikus 129/01a) dengan splenosit tikus DD/c kongenik, dimungkinkan untuk memperoleh sekumpulan klon hibrida yang secara morfologis mirip dengan ESC. Semua klon diisolasi pada media selektif di mana hanya sel dengan hipoksantin fosforibosiltransferase aktif yang dapat tumbuh. Analisis elektroforesis menunjukkan bahwa semua klon memiliki varian alel hipoksantin fosforibosiltransferase yang merupakan karakteristik tikus DD/c. Analisis sitogenetik menunjukkan bahwa tiga dari empat klon hibrida memiliki sekumpulan kromosom yang hampir diploid. Satu klon yang hampir tetraploid mengandung dua populasi sel hibrida, yang satu tetraploid dan yang kedua, yang lebih kecil, diploid.

Analisis mikrosatelit, yang memungkinkan diskriminasi setiap pasangan kromosom homolog tikus 129/01a dan DD/c, dalam klon hibrida dengan set hampir diploid menunjukkan bahwa dalam dua klon ada eliminasi preferensial yang jelas dari autosom pasangan somatik. Sebagian besar autosom dalam klon HESS2 dan HESS3 memiliki penanda garis 129/01a, yaitu, pasangan pluripoten. Pengecualiannya adalah kromosom 1 dan I: dalam klon HESS2 dan HESS3, bersama dengan penanda sel HM-1, penanda pasangan somatik hadir dalam jumlah kecil. Hasil tersebut dapat mencerminkan segregasi kromosom 1 dan I yang tidak lengkap dari pasangan somatik dan konsisten dengan data sitogenetik bahwa trisomi untuk kromosom ini diamati pada 30-40% sel klon HESS2 dan HESS3. Klon HESS4 berbeda secara signifikan dalam komposisi kromosomnya: banyak autosom dalam klon ini berasal dari genom ESC (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14, dan 17), tetapi kromosom 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18, dan 19 diwakili oleh homolog dari kedua orang tua. Rasio kuantitatif mikrosatelit yang menandai kromosom homolog ini kira-kira 1:1. Hal ini memungkinkan penulis untuk berasumsi bahwa satu homolog berasal dari genom ESC, dan yang lainnya dari sel-sel yang berdiferensiasi. Pada beberapa subklon klon HESS4, hanya penanda kromosom 18 dan 19 dari pasangan somatik yang ada. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dalam sel klon HESS4, selain terjadi segregasi kromosom pasangan somatik, terjadi eliminasi satu atau kedua homolog kromosom genom pluripoten yang disebutkan di atas, yaitu terjadi segregasi bilateral kromosom kedua orang tua - fenomena yang sangat tidak biasa, karena segregasi kromosom hanya salah satu orang tua merupakan karakteristik sitohibrid.

Selain itu, setelah pasase ke-20, semua klon sel hibrida hanya mengandung penanda kromosom X pasangan somatik, yaitu kromosom X ESC digantikan oleh kromosom X pasangan somatik dalam klon. Fakta penting ini dikonfirmasi oleh data hibridisasi in situ menggunakan probe berlabel FITC khusus untuk kromosom X tikus: sinyal positif terdeteksi hanya pada satu kromosom. Perlu dicatat bahwa pada tahap awal kultivasi (sebelum pasase ke-15), menurut data sitogenetik, banyak sel mengandung dua kromosom X. Oleh karena itu, penggunaan media selektif memungkinkan manipulasi komposisi kromosom sel hibrida dan pemilihan selektif klon yang membawa kromosom tunggal pasangan somatik dengan latar belakang genom ESC.

Karena fitur unik genom sitohibrid adalah lokalisasi genom parental dalam satu nukleus, pertanyaan yang muncul secara alami adalah tentang pelestarian sifat pluripoten genom embrionik dalam hibrida sel somatik-ESC dalam kondisi kontak dekat dengan genom sel yang berdiferensiasi. Secara morfologis, sitohibrid sel somatik dan ESC mirip dengan garis keturunan sel induk. Evaluasi pluripotensi menunjukkan bahwa semua klon dengan set kromosom yang mendekati diploid mampu membentuk badan embrioid dalam kultur suspensi, yang di dalamnya terdapat turunan dari tiga lapisan germinal.

Sebagian besar sel hibrida mengandung antigen ECMA-7, penanda karakteristik embrio tikus awal, dan juga memiliki aktivitas alkali fosfatase yang tinggi. Data yang paling meyakinkan tentang sifat pluripotensi tinggi sel hibrida diperoleh dalam percobaan untuk memperoleh serangkaian kimera injeksi yang melibatkan sel hibrida klon HESS2. Analisis penanda biokimia menunjukkan bahwa keturunan sel hibrida donor terdapat di sebagian besar jaringan kimera. Oleh karena itu, sel hibrida yang diperoleh dengan menggabungkan ESC dan sel somatik yang berdiferensiasi mempertahankan pluripotensi pada tingkat tinggi, termasuk kemampuan untuk membentuk kimera saat disuntikkan ke dalam rongga blastokista.

Klon HESS2 dan HESS4 berbeda secara signifikan dalam komposisi kromosom parental, tetapi memiliki sifat pluripotensi yang serupa. Dapat diasumsikan bahwa pluripotensi dalam genom hibrida memanifestasikan dirinya sebagai sifat dominan, tetapi ada kemungkinan bahwa tidak semua kromosom genom embrionik terlibat dalam proses mempertahankan pluripotensi. Jika asumsi ini benar, maka dapat diharapkan bahwa eliminasi beberapa kromosom pasangan pluripotensi dari genom sel hibrida tidak akan disertai dengan perubahan status pluripotensi mereka. Dalam hal ini, analisis segregasi kromosom parental dalam sel hibrida embrionik akan memungkinkan kita untuk mendekati identifikasi kromosom yang bertanggung jawab atas pengendalian pluripotensi sel embrionik.

O. Serov dkk. (2001) tidak menemukan keturunan di antara 50 keturunan yang diperoleh dengan menyilangkan chimera dengan tikus normal yang memiliki genotipe tikus 129/01a dan membawa kromosom X tikus DD. Penulis percaya bahwa hal ini disebabkan oleh penurunan pluripotensi pada sel hibrida di bawah pengaruh genom somatik. Penjelasan alternatif mungkin adalah efek negatif trisomi pada beberapa autosom dan ketidakseimbangan kromosom seks (XXY diamati pada sel hingga bagian ke-15) pada sel hibrida selama meiosis. Diketahui bahwa sel XXY tidak dapat menjalani meiosis dan membentuk gamet. Trisomi juga dapat menyebabkan penurunan aktivitas proliferatif sel hibrida, sehingga keuntungan selektif dalam pengembangan chimera mungkin dimiliki oleh sel embrio penerima. Oleh karena itu, untuk penilaian yang memadai terhadap potensi pluripotensi sel hibrida, perlu untuk mendapatkan klon hibrida dengan set kromosom diploid normal.

Dalam percobaan O. Serov dan rekan penulis (2001), kemungkinan pemrograman ulang kromosom X sel somatik dalam genom sel hibrida ditunjukkan untuk pertama kalinya. Kesimpulan penulis ini mengikuti analisis ekspresi gen hprt (penanda kromosom X) dalam chimera: keberadaan varian alel hprt tikus DD/c terdeteksi di semua jaringan chimeric yang dianalisis. Adalah tepat untuk menekankan bahwa setelah pengenalan sel hibrida ke dalam rongga blastokista, sitohibrid jatuh ke dalam kondisi non-selektif dan pelestarian kromosom X dalam genom sel hibrida berarti bahwa ia telah menjadi komponen wajibnya dan genom tidak membedakannya dari kromosom Y dari pasangan pluripoten.

Merangkum hasil analisis interaksi genom somatik dan pluripotensi dalam sel embrionik hibrida, penulis menyimpulkan bahwa dalam beberapa sitohibrida, pluripotensi terwujud sebagai sifat dominan. Genom hibrida mampu memprogram ulang kromosom individu dari sel-sel yang berdiferensiasi, yang, bagaimanapun, tidak mengecualikan kemungkinan efek terbalik genom somatik pada pluripotensi genom embrionik. Ketika membudidayakan sel hibrida, induksi diferensiasi terjadi secara signifikan lebih sering daripada pada garis induk asli ESC HM-1. Efek serupa diamati selama pembentukan koloni primer: banyak koloni primer sel hibrida embrionik berdiferensiasi pada tahap awal pembentukan dengan kehilangan klon yang besar selama seleksi dan reproduksi mereka.

Dengan demikian, sitohibrid yang dibuat oleh fusi sel punca embrionik dengan sel somatik, meskipun kontak dekat dengan genom sel yang berdiferensiasi, mempertahankan pluripotensi sebagai sifat unik genom embrionik. Selain itu, dalam sel hibrida tersebut, pemrograman ulang kromosom individual yang berasal dari sel yang berdiferensiasi dimungkinkan. Masih belum jelas sejauh mana sifat pluripotensi genom embrionik dipertahankan dalam sel hibrida, khususnya, kemampuannya untuk berpartisipasi dalam pembentukan garis benih dalam chimera. Ini memerlukan perolehan sel hibrida embrionik dengan kariotipe normal. Dalam kasus apa pun, sel hibrida embrionik pluripotensi dapat menjadi model genetik nyata untuk mengidentifikasi kromosom yang terlibat dalam mempertahankan pluripotensi atau mengendalikannya, karena segregasi bilateral kromosom parental berpotensi memberikan peluang seperti itu.

Yang tidak kalah menarik adalah studi tentang fenomena yang didefinisikan oleh O. Serov et al. (2001) sebagai “memori kromosom”. Dalam genom hibrida, kromosom homolog berada dalam dua konfigurasi alternatif: homolog dari pasangan somatik pernah mengalami diferensiasi, sedangkan pada homolog dari pasangan pluripoten proses ini baru saja dimulai. Akibatnya, pelestarian sifat pluripoten tinggi oleh sel hibrida menunjukkan bahwa konfigurasi “pluripoten” homolog ESC cukup stabil dalam genom hibrida, meskipun ada pengaruh faktor transaksi yang berasal dari pasangan somatik. Tanda-tanda reprogramming kromosom homolog genom yang terdiferensiasi selama perkembangan chimera yang dijelaskan di atas tidak mengesampingkan kemungkinan bahwa pada tahap awal pembentukan dan pembudidayaan sitohibrid secara in vitro, mereka mempertahankan status yang diperoleh selama diferensiasi secara in vivo. Menurut data yang diperoleh baru-baru ini, ketika sel hibrida embrionik dipindahkan ke lingkungan non-selektif, sel tersebut menunjukkan eliminasi intensif kromosom hanya dari pasangan somatik, yaitu, genom sel hibrida dengan mudah membedakan homolog setelah kultur in vitro selama 10-15 bagian. Dengan demikian, sel hibrida embrionik merupakan model eksperimental yang menjanjikan untuk mempelajari tidak hanya sifat dasar genom embrionik seperti pluripotensi, tetapi juga alternatifnya - diferensiasi embrionik.

Khasiat Terapi Transplantasi Sel Punca Embrionik

Sebelum menganalisis efikasi terapeutik transplantasi sel punca embrional dan turunannya, kami merangkum materi di atas. Kemampuan sel punca embrional dalam hal implementasi penuh embriogenesis in vitro tidaklah memadai, karena cacat perkembangan dalam kasus ini disebabkan oleh tidak adanya sel punca mesenkimal, yang muncul dalam tubuh secara otonom dan independen dari sel punca embrional. Potensi genetik sel punca embrional lebih rendah daripada potensi genetik zigot, oleh karena itu sel punca embrional tidak digunakan secara langsung untuk mengkloning embrio. Potensi biologis unik sel punca embrional sebagai satu-satunya sel yang program pengembangannya diterapkan sepenuhnya dalam implementasi yang konsisten digunakan dalam studi fungsi gen. Dengan bantuan sel punca embrional, kombinasi pertama sinyal yang mengaktifkan ekspresi gen awal dan akhir yang mengkodekan perkembangan tiga lapisan germinal didekodekan. Pelestarian pluripotensi genom sel punca embrional in vitro menjadikannya alat unik untuk regenerasi reparatif, yang mampu secara otomatis mengisi kembali kehilangan seluler jika terjadi kerusakan pada organ dan jaringan. Dalam skenario hipotetis yang ideal, dapat diasumsikan bahwa "... ketika mencangkok sel ESC donor, program yang dikemas secara kompak ditransfer ke dalam tubuh penerima, yang, dalam kondisi yang menguntungkan, diwujudkan dalam pembangunan jaringan baru'7, yang mampu "... secara efektif diintegrasikan ke dalam tubuh penerima baik pada tingkat morfologi maupun fungsional."

Tentu saja, setelah pengembangan metode untuk monodiferensiasi ESC, studi in vivo tentang aktivitas fungsional sel yang diperoleh secara in vitro dari satu klon khusus dimulai. Klon ESC yang berkembang biak menghasilkan populasi sel progenitor yang bermigrasi yang benar-benar mampu berintegrasi secara aktif ke area kerusakan jaringan penerima, yang digunakan dalam pengobatan regeneratif-plastik. Telah ditetapkan bahwa transplantasi neuron DOPA ke substantia nigra mengurangi manifestasi klinis pada hemiparkinsonisme eksperimental. Transplantasi regional sel induk saraf donor mengurangi tingkat gangguan motorik yang disebabkan oleh trauma atau kontusio sumsum tulang belakang dan otak. Hasil positif pertama dari transplantasi sel induk pada penyakit demielinasi juga telah diperoleh. Tampaknya potensi regeneratif-plastik ESC membuka kemungkinan tak terbatas untuk penggunaan transplantasi sel dalam pengobatan praktis. Namun, ketika ditransplantasikan ke zona ektopik, ESC pasti berubah menjadi tumor. Teratoma terbentuk ketika ESC disuntikkan secara subkutan ke tikus yang mengalami defisiensi imun. Ketika suspensi ESC ditransplantasikan di bawah kapsul testis pada tikus singeneik, teratoma juga terbentuk, yang terdiri dari berbagai jaringan, yang sel-selnya merupakan turunan dari ketiga lapisan germinal. Pada teratoma seperti itu, proses organogenesis yang berkurang sangat jarang terjadi.

Sejumlah penelitian memberikan informasi tentang hasil positif transplantasi turunan ESC awal ke hewan dengan patologi eksperimental. Neurotransplantasi seluler menggunakan turunan ESC sedang dikembangkan lebih lanjut dalam eksperimen dan uji klinis pertama untuk memperbaiki gangguan fungsional pada cedera otak dan tulang belakang, dan untuk mengobati siringomielia dan multiple sclerosis (Repin, 2001). Dengan munculnya teknik neurogenesis in vitro dari ESC, alih-alih menggunakan jaringan otak embrionik, metode sedang dikembangkan untuk transplantasi turunan neurosphere yang diperoleh dari kultur jaringan saraf embrionik. Suspensi transplantasi tersebut secara signifikan lebih homogen dan mengandung prekursor neuron dan neuroglia yang berkomitmen.

Dengan penambahan asam retinoat secara teratur pada dosis 10 μg/ml ke dalam media kultur selama 6 minggu, lebih dari 80% neuron pascamitotik terbentuk pada garis embrio-(terato)-karsinoma manusia NTERA-2. Homogenitas lengkap populasi neuron dicapai dengan penyortiran aliran neuron dewasa yang diberi label dengan penanda imunofenotipik, yang memungkinkan pembuangan sisa-sisa teratokarsinoma dan sel-sel yang belum matang. Setelah transplantasi ke berbagai daerah otak hewan percobaan, neuron tersebut tidak hanya bertahan hidup, tetapi juga terintegrasi ke dalam jaringan saraf regional. Pada hewan dengan model eksperimental cacat SSP lokal, neurotransplantasi mengurangi manifestasi klinis dari patologi manusia seperti konsekuensi dari cedera otak traumatis, stroke, penyakit demielinasi, cacat bawaan dalam perkembangan otak kecil, penyakit deposisi lipid dan polisakarida.

Untuk mengoptimalkan proses regenerasi pada penyakit degeneratif sistem saraf pusat, teknologi sedang dikembangkan untuk memperoleh oligodendrosit penghasil mielin dari sel punca sel punca. Tahap pertama secara tradisional mencakup proliferasi sel punca sel punca dengan reproduksi jumlah sel yang diperlukan untuk transplantasi. Pada tahap kedua, diferensiasi sel yang ditargetkan menjadi populasi prekursor oligodendrosit penghasil mielin dilakukan, yang dikendalikan oleh antigen penanda selektif.

Prospek tertentu terbuka untuk penggunaan turunan ESC untuk pengembangan metode untuk mengoreksi defisiensi imun yang disebabkan oleh cacat genetik dalam pematangan timus. Dalam penelitian pada tikus knockout (rag 1) dengan cacat gen yang diinduksi - gangguan mekanisme rekombinasi lokus V(D)J gen TCR, yang menyebabkan hilangnya fungsi limfosit T, transplantasi turunan ESC awal ke dalam timus hewan mengembalikan pematangan populasi normal klon imun yang bertanggung jawab atas imunitas seluler. Uji klinis transplantasi ESC preformed in vitro untuk pengobatan anemia herediter yang fatal pada anak-anak sedang berlangsung.

Keberatan terhadap pengenalan cepat transplantasi sel punca ke klinik didasarkan pada terbatasnya jumlah galur sel punca embrionik manusia yang stabil dan perlunya standarisasi. Untuk meningkatkan kemurnian galur ESC yang terstandarisasi, serta sel punca manusia dewasa, diusulkan untuk menggunakan metode pemilihan galur berdasarkan analisis genetik molekuler pengulangan DNA tandem pendek. Juga perlu untuk menguji galur ESC untuk mengetahui adanya penataan ulang kromosom kecil dan mutasi genetik, yang potensinya untuk terjadi dalam kondisi kultur sel cukup tinggi. Sebuah tesis diajukan tentang pengujian wajib terhadap sifat-sifat semua jenis ESC dan sel punca pluripoten regional, karena reproduksinya secara in vitro dapat menyebabkan munculnya karakteristik baru yang tidak melekat pada sel punca embrionik atau jaringan definitif. Secara khusus, diasumsikan bahwa kultivasi jangka panjang dalam media dengan sitokin membawa galur ESC lebih dekat ke sel tumor, karena mereka mengalami perubahan serupa dalam jalur regulasi siklus sel dengan perolehan kemampuan untuk melakukan pembelahan sel dalam jumlah yang tidak terbatas. Beberapa penulis, berdasarkan potensi perkembangan tumor, menganggap transplantasi turunan sel punca embrionik awal ke manusia sebagai tindakan yang gegabah. Menurut pendapat mereka, jauh lebih aman untuk menggunakan keturunan sel punca embrionik yang sudah terbentuk, yaitu garis sel progenitor yang telah berdiferensiasi. Namun, saat ini, teknik yang andal untuk memperoleh garis sel manusia yang stabil yang berdiferensiasi ke arah yang diinginkan belum dikembangkan.

Dengan demikian, semakin banyak data tentang efek terapi positif transplantasi turunan sel punca embrionik manusia muncul dalam literatur. Akan tetapi, banyak dari penelitian ini yang sedang ditinjau dan dikritik. Beberapa peneliti percaya bahwa hasil uji klinis awal bersifat awal dan hanya menunjukkan bahwa sel punca mampu memberikan efek yang menguntungkan pada perjalanan klinis suatu penyakit tertentu. Oleh karena itu, perlu untuk memperoleh data tentang hasil transplantasi sel yang jauh. Tahapan pengembangan neurotransplantologi klinis dikutip sebagai argumen. Memang, pada awalnya, publikasi tentang efisiensi tinggi transplantasi fragmen otak embrionik pada penyakit Parkinson berlaku dalam literatur, tetapi kemudian laporan mulai muncul yang menyangkal efisiensi terapi jaringan saraf embrionik atau janin yang ditransplantasikan ke otak pasien.

Uji klinis pertama dilakukan untuk menilai keamanan transplantasi neuroblas yang berasal dari sel punca teratokarsinoma NTERA-2, sel-sel yang belum matang yang mengalami proliferasi dalam kultur hingga terkumpul 100 juta massa sel. Beberapa sel yang diperoleh dengan cara ini digunakan untuk mengkarakterisasi fenotipe dan menentukan ketidakmurnian sel, serta untuk menguji kemungkinan kontaminasi dengan virus dan bakteri. LIF dan lapisan pengumpan sel stroma janin dikeluarkan dari media kultur, dan kondisi diciptakan untuk diferensiasi target ESC menjadi neuroblas menggunakan kombinasi sitokin dan faktor pertumbuhan. Kemudian neuroblas dimurnikan dari sel-sel teratokarsinoma yang belum matang pada pemilah sel aliran. Setelah pemurnian sekunder dan karakterisasi fenotipe sel yang ditransplantasikan, suspensi neuroblas (10-12 juta) disuntikkan ke dalam nukleus basal otak pasien (pada bulan ketujuh setelah stroke hemoragik) menggunakan mikrokanula dan spuit khusus di bawah kendali stereotaxic dan computed tomography. Pemeriksaan satu tahun pascatransplantasi terhadap konsekuensi transplantasi neuron ke zona stroke tidak menemukan efek samping atau efek yang tidak diinginkan. Setengah dari pasien menunjukkan perbaikan fungsi motorik dalam periode 6 hingga 12 bulan setelah transplantasi. Perubahan klinis yang positif disertai dengan peningkatan suplai darah ke zona stroke setelah transplantasi sel: peningkatan rata-rata penyerapan 2-deoksiglukosa berlabel fluoresensi, menurut tomografi emisi positron, mencapai 18%, dan pada beberapa pasien - 35%.

Namun, Institut Kesehatan Nasional AS melakukan studi independen tentang efektivitas klinis neurotransplantasi pada pasien dengan Parkinsonisme. Pasien dalam kelompok pertama ditransplantasi dengan bagian jaringan saraf embrio yang menghasilkan dopamin, sementara kelompok pasien kedua menjalani operasi palsu. Hasilnya menunjukkan tidak ada efektivitas klinis dari neurotransplantasi tersebut, meskipun faktanya neuron embrio yang menghasilkan dopamin bertahan hidup di otak penerima. Selain itu, 2 tahun setelah transplantasi jaringan saraf embrio, 15% pasien mengalami diskinesia persisten, yang tidak ada pada pasien dalam kelompok plasebo (Sel induk: kemajuan ilmiah dan arah penelitian masa depan. Nat. Inst, Kesehatan. AS). Pengamatan perkembangan penyakit lebih lanjut pada pasien ini sedang berlangsung.

Beberapa penulis mengaitkan data literatur yang kontradiktif mengenai penilaian efektivitas klinis neurotransplantasi dengan pendekatan yang berbeda terhadap pemilihan kelompok pasien, pilihan metode yang tidak memadai untuk menilai kondisi mereka secara objektif, dan, yang terpenting, periode perkembangan jaringan saraf embrio yang berbeda dan area otak yang berbeda dari mana jaringan ini diperoleh, ukuran transplantasi yang berbeda dan fitur metodologis intervensi bedah.

Perlu dicatat bahwa upaya transplantasi langsung sel induk embrionik pluripoten ke daerah striatum otak tikus dengan hemiparkinsonisme eksperimental disertai dengan proliferasi ESC dan diferensiasinya menjadi neuron dopaminergik. Harus diasumsikan bahwa neuron yang baru terbentuk terintegrasi secara efektif ke dalam jaringan saraf, karena setelah transplantasi ESC, koreksi anomali perilaku dan asimetri motorik dalam uji apomorfin diamati. Pada saat yang sama, beberapa hewan mati karena transformasi ESC yang ditransplantasikan menjadi tumor otak.

Para ahli dari Akademi Kedokteran dan Nasional Amerika Serikat, serta para spesialis dari Institut Kesehatan Nasional Amerika Serikat meyakini bahwa potensi klinis sel punca layak mendapat perhatian paling serius, tetapi menekankan perlunya studi terperinci tentang sifat-sifatnya, kemungkinan komplikasi, dan konsekuensi jangka panjang dalam eksperimen pada model biologis penyakit manusia yang memadai (Sel punca dan pengobatan regeneratif masa depan National Academy Press.; Sel punca dan arah penelitian masa depan. Nat. Inst, of Health USA).

Dari sudut pandang ini, penting bahwa analisis histologis komparatif teratoma eksperimental yang diperoleh dengan transplantasi suspensi ESC ke dalam testis dengan teratoma yang terbentuk sebagai hasil transplantasi embrio awal, yang juga mengandung ESC, menunjukkan bahwa ESC, terlepas dari sumber asal atau interaksinya dengan sel-sel di sekitarnya, menerapkan potensi tumorigeniknya dengan cara yang sama. Telah terbukti bahwa teratoma tersebut memiliki asal klonal, karena tumor yang terdiri dari turunan dari ketiga lapisan germinal dapat muncul dari satu ESC (Rega, 2001). Perlu dicatat bahwa ketika ESC klonal dengan kariotipe normal ditransplantasikan ke tikus imunodefisiensi, teratoma yang terdiri dari berbagai jenis sel somatik yang berdiferensiasi juga terbentuk. Data eksperimental ini adalah bukti sempurna dari asal klonal teratoma. Dari sudut pandang biologi perkembangan, mereka menunjukkan bahwa bukan beberapa sel progenitor yang berkomitmen, tetapi satu sel induk pluripoten bertindak sebagai sumber turunan berdiferensiasi dari ketiga lapisan germinal yang membentuk teratoma. Akan tetapi, dalam perjalanan menuju transplantasi sel yang praktis, hasil penelitian ini, jika tidak menjadi penghalang, maka merupakan tanda peringatan akan potensi bahaya, karena inokulasi ESC atau sel germinal primordial ke dalam berbagai jaringan tikus dewasa yang mengalami defisiensi imun pasti menyebabkan perkembangan tumor dari sel induk yang ditransplantasikan. Degenerasi neoplastik ESC yang ditransplantasikan secara ektopik disertai dengan munculnya populasi satelit sel yang berdiferensiasi - karena diferensiasi parsial ESC dan klon progenitor menjadi garis-garis khusus. Menariknya, ketika ESC ditransplantasikan ke otot rangka, neuron paling sering terbentuk di samping sel teratokarsinoma. Akan tetapi, pengenalan ESC ke dalam sel telur atau blastokista yang membelah disertai dengan integrasi sel yang lengkap ke dalam embrio tanpa pembentukan elemen neoplastik. Dalam hal ini, ESC terintegrasi ke dalam hampir semua organ dan jaringan embrio, termasuk primordium genital. Hewan alofen tersebut pertama kali diperoleh dengan memasukkan sel teratokarsinoma 129 ke dalam embrio awal pada tahap sel 8-100. Pada tikus alofen, populasi sel heterogen yang berasal dari sel punca sel donor diintegrasikan ke dalam jaringan sumsum tulang, usus, kulit, hati, dan alat kelamin, yang memungkinkan terciptanya bahkan chimera sel antarspesies dalam percobaan. Semakin pendek periode perkembangan embrio awal, semakin tinggi persentase chimerisasi sel, dengan tingkat chimerisasi tertinggi diamati dalam sistem hematopoietik, kulit, sistem saraf, hati, dan usus halus embrio alofen. Pada organisme dewasa, jaringan yang dilindungi dari sistem imun penerima oleh penghalang histohematik rentan terhadap chimerisasi:transplantasi sel germinal primer ke dalam parenkim testis disertai dengan penggabungan sel induk donor ke dalam lapisan jaringan germinal penerima. Namun, ketika mentransplantasikan sel germinal primer ke dalam blastokista, pembentukan rudimen chimeric dari organ seksual dengan pembentukan sel germinal primer donor tidak terjadi. Pluripotensi sel germinal primer, ketika kondisi khusus tercipta, juga dapat digunakan untuk kloning: transplantasi sel germinal primer tikus ke dalam embrio tikus 8-16 sel, di mana mitosis seluler diblokir oleh sitokalsin, mendorong penerapan embriogenesis normal dengan perkembangan embrio dari sel germinal primer donor.

Oleh karena itu, alternatif untuk transplantasi ESC alogenik adalah kloning terapeutik berdasarkan transplantasi inti sel somatik ke dalam sel telur yang dienukleasi untuk membuat blastokista, dari massa sel bagian dalam yang mana garis-garis ESC yang secara genetik identik dengan donor inti somatik kemudian diisolasi. Secara teknis, ide ini cukup layak, karena kemungkinan menciptakan garis-garis ESC dari blastokista yang diperoleh setelah transplantasi inti somatik ke dalam sel telur yang dienukleasi telah berulang kali terbukti dalam percobaan pada hewan laboratorium (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Secara khusus, pada tikus yang homozigot untuk mutasi gen rag2, fibroblas yang diperoleh dengan membudidayakan sel-sel jaringan subepidermal digunakan sebagai donor inti, yang ditransplantasikan ke dalam oosit yang dienukleasi. Setelah aktivasi oosit, "zigot" dikultur hingga pembentukan blastokista, dari massa sel bagian dalam yang mana ESC diisolasi dan ditransfer ke garis sel yang nullizygous untuk gen mutan (rag2~/~). Mutasi satu gen alel dikoreksi dalam sel-sel ESC tersebut dengan metode rekombinasi homolog. Dalam rangkaian percobaan pertama, badan embrioid diperoleh dari sel-sel ESC dengan gen yang dipulihkan secara rekombinan, sel-selnya ditransfeksi dengan retrovirus rekombinan (HoxB4i/GFP) dan, setelah reproduksi, disuntikkan ke dalam vena tikus rag2~/~. Dalam rangkaian kedua, blastomer tetraploid diagregasi dengan sel-sel ESC yang dimodifikasi secara genetik dan ditransplantasikan ke betina penerima. Tikus imunokompeten yang dihasilkan berfungsi sebagai donor sumsum tulang untuk transplantasi ke tikus mutan rag2~/~. Dalam kedua rangkaian hasilnya positif: setelah 3-4 minggu sel-sel myeloid dan limfoid normal yang matang yang mampu menghasilkan imunoglobulin ditemukan pada semua tikus. Dengan demikian, transplantasi inti sel somatik ke dalam oosit dapat digunakan tidak hanya untuk mendapatkan garis sel ESC, tetapi juga untuk sitogenoterapi - koreksi anomali herediter, menggunakan ESC sebagai vektor untuk pengangkutan informasi genetik korektif. Namun arah transplantasi sel ini, selain masalah bioetika, juga memiliki keterbatasan. Tidak jelas seberapa aman transplantasi sel kloning terapeutik dengan genotipe yang identik dengan genotipe pasien tertentu, karena sel tersebut dapat menimbulkan mutasi yang menciptakan kecenderungan terhadap penyakit lain. Telur manusia normal tetap menjadi objek yang sulit diakses, sedangkan bahkan dengan transplantasi nukleus somatik ke dalam telur hewan yang dienukleasi, hanya 15-25% dari "zigot" yang dikonstruksi berkembang ke tahap blastokista. Belum ditentukan berapa banyak blastokista yang diperlukan untuk memperoleh satu baris sel punca sel punca kloning pluripoten. Perlu juga dicatat tingginya tingkat biaya finansial yang terkait dengan kompleksitas metodologi kloning terapeutik.

Sebagai kesimpulan, perlu dicatat bahwa dalam sel punca embrionik, pluripotensi genom dengan DNA hipometilasi dikombinasikan dengan aktivitas telomerase tinggi dan fase C^ pendek dari siklus sel, yang memastikan reproduksi intensif dan berpotensi tak terbatas, di mana sel punca embrionik mempertahankan satu set kromosom diploid dan satu set karakteristik fenotipik "juvenil". Pertumbuhan klonal sel punca embrionik dalam kultur tidak mengganggu diferensiasinya menjadi garis sel khusus organisme apa pun ketika proliferasi dihentikan dan sinyal pengatur yang sesuai ditambahkan. Diferensiasi restriksi sel punca embrionik menjadi garis sel somatik in vitro diwujudkan tanpa partisipasi mesenkim, melewati Nochteys, di luar organogenesis dan tanpa pembentukan embrio. Pengenalan ektopik sel punca embrionik in vivo pasti mengarah pada pembentukan teratokarsinoma. Transplantasi sel punca embrionik ke dalam blastokista atau embrio awal disertai dengan integrasinya dengan jaringan embrionik dan kimerisasi organ-organnya yang stabil.

Teknologi regeneratif-plastik yang berbasis pada transplantasi sel merupakan titik temu kepentingan para perwakilan biologi sel, biologi perkembangan, genetika eksperimental, imunologi, neurologi, kardiologi, hematologi, dan banyak cabang lain dari pengobatan eksperimental dan praktis. Hasil terpenting dari studi eksperimental membuktikan kemungkinan pemrograman ulang sel punca dengan perubahan yang ditargetkan pada sifat-sifatnya, yang membuka prospek untuk mengendalikan proses sitodiferensiasi menggunakan faktor pertumbuhan - untuk regenerasi miokard, pemulihan lesi SSP, dan normalisasi fungsi aparatus pulau pankreas. Namun, untuk pengenalan transplantasi turunan ESC secara luas ke dalam pengobatan praktis, perlu untuk mempelajari sifat-sifat sel punca manusia secara lebih rinci dan melanjutkan eksperimen dengan ESC pada model penyakit eksperimental.

Masalah bioetika dan masalah penolakan transplantasi sel alogenik dapat diselesaikan dengan plastisitas genom sel punca regional organisme dewasa yang ditemukan. Namun, informasi awal bahwa ketika mentransplantasikan sel autolog hematopoietik yang diisolasi dan dikarakterisasi dengan hati-hati ke dalam hati, dari mana hepatosit baru berasal, berintegrasi ke dalam lobulus hati, sekarang sedang direvisi dan dikritik. Meskipun demikian, data telah dipublikasikan bahwa transplantasi sel punca saraf ke dalam timus menyebabkan pembentukan tunas donor limfosit T dan B baru, dan transplantasi sel punca saraf otak ke dalam sumsum tulang menyebabkan pembentukan tunas hematopoietik dengan mielo- dan eritropoiesis donor jangka panjang. Akibatnya, sel punca pluripoten yang mampu memprogram ulang genom ke potensi ESC dapat bertahan di organ organisme dewasa.

Sumber perolehan ESC untuk keperluan medis tetaplah embrio manusia, yang telah menentukan keniscayaan persimpangan baru masalah moral, etika, hukum, dan agama pada titik asal kehidupan manusia. Penemuan ESC telah memberikan dorongan kuat untuk dimulainya kembali diskusi-diskusi alot tentang di mana garis batas antara sel hidup dan materi, keberadaan, dan kepribadian. Pada saat yang sama, tidak ada norma, aturan, dan hukum universal mengenai penggunaan ESC dalam pengobatan, meskipun ada upaya berulang kali untuk membuat dan mengadopsinya. Setiap negara bagian, dalam kerangka perundang-undangannya, memecahkan masalah ini secara independen. Sementara itu, para dokter di seluruh dunia terus mencoba untuk membawa pengobatan regeneratif-plastik melampaui cakupan diskusi semacam itu, terutama melalui penggunaan cadangan sel punca dewasa daripada sel punca embrionik.

Sedikit sejarah isolasi sel induk embrionik

Sel-sel terato(embrio)karsinoma diisolasi dari teratoma testis yang muncul secara spontan pada tikus 129/ter-Sv, teratoma ovarium spontan pada tikus Lt/Sv, dan dari teratoma yang berasal dari sel atau jaringan embrionik yang ditransplantasikan secara ektopik. Di antara lini sel terato(embrio)karsinoma tikus stabil yang diperoleh dengan cara ini, beberapa bersifat pluripoten, yang lain hanya berdiferensiasi menjadi satu jenis sel tertentu, dan beberapa sama sekali tidak mampu melakukan sitodiferensiasi.

Pada suatu waktu, fokusnya adalah pada penelitian yang hasilnya menunjukkan kemungkinan mengembalikan sel terato-(embrio)-karsinoma ke fenotipe normal setelah dimasukkan ke dalam jaringan embrio yang sedang berkembang, serta pekerjaan pada penciptaan in vitro sel terato-(embrio)-karsinoma yang dimodifikasi secara genetik, dengan bantuan tikus mutan yang diperoleh untuk pemodelan biologis patologi keturunan manusia.

Kultur suspensi terkondisi digunakan untuk mengisolasi lini sel terato-(embrio)-karsinoma. Dalam kultur, sel terato-(embrio)-karsinoma, seperti ESC, tumbuh membentuk badan embrioid dan memerlukan disosiasi wajib untuk transfer lini, mempertahankan pluripotensi pada lapisan pengumpan fibroblas embrionik atau selama kultur suspensi dalam media terkondisi. Sel-sel dari lini terato-(embrio)-karsinoma pluripoten berukuran besar, bulat, ditandai dengan aktivitas alkali fosfatase yang tinggi, membentuk agregat dan mampu melakukan diferensiasi multiarah. Ketika dimasukkan ke dalam blastokista, mereka beragregasi dengan morula, yang mengarah pada pembentukan embrio kimerik, dalam komposisi berbagai organ dan jaringan yang turunan sel terato-(embrio)-karsinoma ditemukan. Namun, sebagian besar embrio kimerik tersebut mati dalam kandungan, dan dalam organ kimera bayi baru lahir yang bertahan hidup, sel asing jarang terdeteksi dan pada kepadatan rendah. Pada saat yang sama, kejadian tumor (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, jenis tumor ganas lainnya dan adenoma pankreas) meningkat tajam, dan degenerasi tumor sering terjadi selama periode perkembangan intrauterin embrio chimeric.

Sebagian besar sel terato-(embrio)-karsinoma dalam lingkungan mikro sel embrionik normal hampir secara alami memperoleh karakteristik neoplastik ganas. Dipercayai bahwa keganasan ireversibel disebabkan oleh aktivasi proto-onkogen dalam proses penataan ulang struktural. Salah satu pengecualian adalah sel-sel dari garis embriokarsinoma SST3, yang diperoleh dari teratoma testis tikus (garis 129/Sv-ter), yang menunjukkan kemampuan tinggi untuk berintegrasi ke dalam jaringan dan organ embrio tanpa pembentukan tumor berikutnya pada tikus kimerik. Turunan dari garis sel terato-(embrio)-karsinoma pada tikus kimerik praktis tidak berpartisipasi dalam pembentukan gonosit primer. Tampaknya, hal ini disebabkan oleh frekuensi tinggi aberasi kromosom yang menjadi ciri sebagian besar garis terato-(embrio)-karsinoma, di mana sel-sel tersebut diamati aneuploidi dan kelainan kromosom.

Beberapa galur stabil sel terato-(embrio)-karsinoma manusia yang dicirikan oleh pluripotensi, aktivitas proliferatif tinggi, dan kemampuan untuk berdiferensiasi selama pertumbuhan dalam kultur diperoleh dalam kondisi laboratorium. Secara khusus, galur sel terato-(embrio)-karsinoma manusia NTERA-2 digunakan untuk mempelajari mekanisme sitodiferensiasi saraf. Setelah transplantasi sel galur ini ke daerah subventrikular otak depan tikus yang baru lahir, migrasi dan neurogenesisnya diamati. Bahkan ada upaya untuk mentransplantasikan neuron yang diperoleh dengan mengkulturkan sel galur terato-(embrio)-karsinoma NTERA-2 kepada pasien dengan stroke, yang menurut penulis, menyebabkan perbaikan dalam perjalanan klinis penyakit. Pada saat yang sama, tidak ada kasus keganasan sel galur terato-(embrio)-karsinoma NTERA-2 yang ditransplantasikan pada pasien dengan stroke.

Baris pertama sel induk embrionik tikus pluripoten tak berdiferensiasi diperoleh pada awal 1980-an oleh Evans dan Martin, yang mengisolasinya dari massa sel bagian dalam blastokista - embrioblas. Baris ESC yang diisolasi mempertahankan pluripotensi dan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel di bawah pengaruh faktor dalam media kultur khusus untuk waktu yang lama.

Istilah “sel punca pluripoten embrionik” sendiri adalah milik Leroy Stevens, yang, ketika mempelajari efek tar tembakau pada insiden perkembangan tumor, menarik perhatian pada kejadian spontan teratokarsinoma testis pada tikus linear (129/v) dari kelompok kontrol. Sel-sel teratokarsinoma testis dicirikan oleh tingkat proliferasi yang tinggi, dan dengan adanya cairan dari rongga perut, mereka secara spontan berdiferensiasi dengan pembentukan neuron, keratinosit, kondrosit, kardiomiosit, serta fragmen rambut dan tulang, tetapi tanpa tanda-tanda sitoarsitektur yang teratur dari jaringan yang sesuai. Ketika ditempatkan dalam kultur, sel-sel teratokarsinoma tumbuh sebagai klon pluripoten yang tidak melekat pada substrat dan membentuk badan embrioid, setelah itu mereka berhenti membelah dan mengalami diferensiasi tidak teratur spontan menjadi neuron, glia, sel otot, dan kardiomiosit. Stevens menemukan bahwa teratocarcinoma tikus 129/v mengandung kurang dari 1% sel yang mampu berdiferensiasi menjadi berbagai garis somatik khusus, dan diferensiasi itu sendiri bergantung pada faktor-faktor yang memengaruhinya (komposisi cairan peritoneum, produk sel dewasa atau jaringan yang ditambahkan ke kultur). Hipotesis Leroy Stevenson tentang keberadaan sel progenitor embrionik dari garis benih di antara sel-sel teratocarcinoma dikonfirmasi: suspensi sel embrioblas dari embrio praimplantasi dalam jaringan tikus dewasa membentuk teratocarcinoma, dan garis sel murni yang diisolasi darinya setelah pemberian intraperitoneal kepada hewan penerima berdiferensiasi menjadi neuron, kardiomiosit, dan sel somatik lain yang berasal dari ketiga lapisan benih. Dalam percobaan in vivo, transplantasi ESC (diperoleh dari embrioblas, tetapi bukan trofoblas) ke dalam embrio tikus dari garis lain pada tahap blastomer 8-32 menghasilkan kelahiran hewan chimeric (tanpa perkembangan tumor), yang organnya ditemukan tunas jaringan donor. Chimerisme bahkan diamati pada garis sel germinal.

Sel germinal progenitor primer yang diisolasi dari rudimen genital embrio tikus memiliki morfologi, fenotipe imunologi, dan karakteristik fungsional yang sama dengan ESC yang diperoleh Stevenson dari teratokarsinoma dan embrioblas. Pada chimera yang lahir setelah ESC dimasukkan ke dalam blastokista, morfogenesis alofen pada organ dicirikan oleh pergantian mosaik unit struktural dan fungsional donor dan resipien pada hati, paru-paru, dan ginjal. Dalam beberapa kasus, pembentukan kripta intestinal atau lobulus hati yang terdiri dari sel resipien dan donor diamati. Namun, morfogenesis selalu terjadi sesuai dengan program genetik spesies tempat resipien berasal, dan chimera terbatas secara eksklusif pada tingkat seluler.

Kemudian ditetapkan bahwa proliferasi ESC tanpa sitodiferensiasi pada lapisan pengumpan sel yang berasal dari mesenkim (fibroblas janin) terjadi dengan kehadiran wajib LIF dalam media nutrisi selektif, yang secara selektif memastikan kelangsungan hidup hanya sel induk dan sel progenitor, sementara sebagian besar elemen seluler khusus mati. Dengan menggunakan metode tersebut, pada tahun 1998 James Thomson mengisolasi lima garis sel induk embrionik yang diabadikan dari massa sel bagian dalam blastokista manusia. Pada tahun yang sama, John Gerhart mengembangkan metode untuk mengisolasi garis ESC yang abadi dari tuberkulum genital embrio manusia berusia empat hingga lima minggu. Karena sifatnya yang unik, hanya dua tahun kemudian, sel induk embrionik dan sel induk jaringan definitif mulai digunakan dalam praktik pengobatan regeneratif dan terapi gen.