Terapi gen non-virus menawarkan harapan untuk nyeri punggung bawah kronis

Dalam studi terkini yang diterbitkan di jurnal Biomaterials, para peneliti mengembangkan terapi gen non-virus baru untuk mengobati nyeri punggung diskogenik (DBP) dengan memberikan faktor transkripsi Forkhead Box F1 (FOXF1) menggunakan vesikel ekstraseluler (eEV) yang direkayasa ke dalam diskus intervertebralis degeneratif (IVD) secara in vivo.

Nyeri punggung bawah kronis (NBB) merupakan masalah global yang terus berkembang akibat populasi yang menua dan masalah opioid yang semakin memburuk. Perawatan saat ini mencakup penyembuhan jangka pendek atau operasi yang mahal, yang menyoroti perlunya terapi yang tidak adiktif dan kurang invasif.

Pendekatan biologis saat ini, termasuk pemberian faktor pertumbuhan, terapi sel, dan terapi gen virus, dapat mengurangi degenerasi pada model hewan dan manusia. Namun, masalah seperti efek jangka pendek, efikasi jangka panjang yang buruk, dan imunogenisitas serta onkogenisitas yang tidak perlu dapat menghambat penerapan langsung pendekatan ini.

Dalam penelitian ini, para peneliti membuat terapi gen non-virus untuk degenerasi diskus intervertebralis (IVD) menggunakan FOXF1-eEV.

Para peneliti mentransfeksi fibroblas embrionik tikus primer (PMEF) dengan plasmid yang mengandung FOXF1 atau pCMV6 sebagai kontrol dan mengkarakterisasi sampel eEV menggunakan uji pelacakan nanopartikel (NTA).

Mereka menilai pemuatan muatan molekuler yang efisien ke dalam eEV menggunakan reaksi berantai polimerase transkripsi balik kuantitatif (qRT-PCR) dan PCR konvensional. Analisis Western blot mengidentifikasi protein spesifik FOXF1 dan EV dalam formasi eEV. Tim menggunakan plasmid yang meningkatkan daerah polilinker atas dan bawah untuk menentukan keberadaan DNA plasmid FOXF1 dalam sel donor dan menghasilkan eEV.

Mereka memeriksa mRNA panjang penuh yang diproduksi dari DNA plasmid dalam eEV dan sel donor.

Para peneliti menciptakan vesikel ekstraseluler dengan faktor transkripsi untuk memulihkan fungsi jaringan dan mengubah respons nyeri pada model hewan DBP.

Mereka mengidentifikasi EV untuk pengangkutan dan penyaluran FOXF1 ke dalam cakram intervertebralis yang rusak pada model tikus dengan nyeri punggung diskogenik guna menentukan penghambatan eEV FOXF1 terhadap degenerasi cakram intervertebralis.

Tim menggabungkan pengujian biomekanik cakram intervertebralis tikus dengan pencitraan, perubahan matriks ekstraseluler (ECM), dan respons nyeri yang dinilai setelah 12 minggu untuk mengonfirmasi perubahan dalam struktur dan fungsi, serta nyeri, yang disebabkan oleh intervensi terapeutik.

Penilaian nyeri praoperatif dan pascaoperatif meliputi mikro-computed tomography (micro-CT), pencitraan resonansi magnetik (MRI), pengujian mekanis, pewarnaan Alcian blue (AB) dan picrosirius red (PSR), uji dimethylmethylene blue, dan imunohistokimia (IHC).

Penelitian ini melibatkan teknik pembedahan di mana peneliti memberikan Buprenorphine ER secara subkutan kepada tikus untuk mengendalikan nyeri pascaoperasi.

Tim melakukan penilaian perilaku sebelum operasi dan setiap dua minggu dari empat hingga 12 minggu setelah operasi, menggunakan berbagai metode termasuk uji lapangan terbuka, pelat dingin, suspensi ekor, dan suspensi kawat.

Uji lapangan terbuka menilai aktivitas spontan tikus; uji pelat dingin mengukur hiperalgesia termal; uji suspensi ekor mengukur nyeri aksial; dan uji suspensi kawat mengukur kekuatan.

Dua belas minggu setelah operasi, tim membedah tulang belakang lumbar hewan menggunakan penelusuran saraf dan arteri femoralis untuk mengidentifikasi diskus intervertebralis antara L4 dan L5, L5 dan L6, serta L6 dan S1 IVD. Mereka menggunakan IVD L5/L6 untuk menilai histologi dan menentukan kandungan glikosaminoglikan (GAG).

EEV FOXF1 secara signifikan mengurangi respons nyeri sekaligus memulihkan struktur dan fungsi IVD, termasuk peningkatan tinggi cakram, hidrasi jaringan, kandungan proteoglikan, dan sifat mekanis.

Penelitian ini difokuskan pada pelepasan eEV yang mengandung FOXF1 dari fibroblas primer yang ditransfeksi dengan faktor transkripsi FOXF1. PCR RT kuantitatif menunjukkan peningkatan signifikan pada tingkat transkrip mRNA FOXF1 dan tingkat mRNA FOXF1 yang ditranskripsi dengan panjang penuh dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi pCMV6.

Terapi eEV FOXF1 dapat mengurangi respons nyeri pada model tusukan diskus lumbal pada tikus hingga 12 minggu. Tikus betina menunjukkan waktu kejang yang lebih lama pada kelompok yang diobati dengan FOXF1 dibandingkan pada kelompok yang cedera, yang berlangsung setidaknya selama 12 minggu setelah pengobatan.

Terapi eEV FOXF1 meningkatkan hidrasi dan tinggi jaringan IVD pada hewan yang terluka dan degeneratif secara in vivo, sekaligus mempertahankan tingkat hidrasi dan intensitas gambar berbobot cakram IVD T2.

Namun, tim mengamati adanya penurunan tinggi cakram pada hewan yang cedera dan hewan yang diobati dengan eEV pCMV6. Tikus yang diobati dengan eEV FOXF1 tidak mengalami penurunan tinggi cakram 12 minggu setelah pengobatan. Jenis kelamin tidak memengaruhi hasil fungsional.

EEV FOXF1 memulihkan fungsi mekanis IVD yang rusak dan mengalami degenerasi secara in vivo. Di bawah tekanan aksial, IVD yang diobati dengan eEV FOXF1 menunjukkan kekakuan NZ yang lebih tinggi dibandingkan dengan IVD yang rusak.

Dalam kondisi merayap, IVD yang rusak memperlihatkan peningkatan perpindahan merayap yang dinormalisasi, yang menunjukkan penurunan kekakuan elastis merayap yang dinormalisasi.

Hasilnya menunjukkan bahwa pengurangan kandungan GAG pada IVD yang rusak meningkatkan fleksibilitas mekanis, tetapi terapi eEV mencegah hilangnya glikosaminoglikan dan perubahan selanjutnya dalam fungsi mekanis.

EEV FOXF1 menginduksi perubahan struktural dan fungsional pada IVD dengan meningkatkan kadar proteoglikan dan GAG.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa eEV yang dimuat dengan faktor transkripsi perkembangan dapat mengobati penyakit sendi yang menyakitkan seperti DBP dengan mengirimkan faktor transkripsi ini ke sendi yang degeneratif dan nyeri melalui IVD.

Strategi ini dapat membantu mengurangi kelainan struktural dan fungsional yang disebabkan oleh penyakit dan mengatur respons nyeri sesuai jenis kelamin.

Para peneliti juga merekomendasikan penggunaan faktor transkripsi perkembangan seperti FOXF1 untuk mengubah sel NP degeneratif ke keadaan pro-anabolik in vivo. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan kemanjuran terapeutiknya.