Peran enzim dan sitokin dalam patogenesis osteoartritis

Dalam beberapa tahun terakhir, banyak perhatian peneliti telah difokuskan pada identifikasi protease yang bertanggung jawab atas degradasi ECM tulang rawan artikular pada osteoartrosis. Menurut konsep modern, metaloprotease matriks (MMP) memainkan peran penting dalam patogenesis osteoartrosis. Pada pasien dengan osteoartrosis, peningkatan kadar tiga MMP terdeteksi - kolagenase, stromelysin dan gelatinase. Kolagenase bertanggung jawab atas degradasi kolagen asli, stromelysin - kolagen tipe IV, proteoglikan dan laminin, gelatinase - untuk degradasi gelatin, kolagen tipe IV, Vh XI, elastin. Selain itu, keberadaan enzim lain - agrekanase, yang memiliki sifat MMP dan bertanggung jawab atas proteolisis agregat proteoglikan tulang rawan, diasumsikan.

Tiga jenis kolagenase telah diidentifikasi dalam tulang rawan artikular manusia, yang kadarnya meningkat secara signifikan pada pasien dengan osteoartritis: kolagenase-1 (MMP-1), kolagenase-2 (MMP-8), dan kolagenase-3 (MMP-13). Koeksistensi tiga jenis kolagenase yang berbeda dalam tulang rawan artikular menunjukkan bahwa masing-masing dari mereka memainkan peran spesifiknya sendiri. Memang, kolagenase-1 dan -2 terlokalisasi terutama di zona intermediet superfisial dan atas tulang rawan artikular, sementara kolagenase-3 ditemukan di zona intermediet bawah dan di zona dalam. Selain itu, hasil studi imunohistokimia menunjukkan bahwa seiring perkembangan osteoartritis, kadar kolagenase-3 mencapai dataran tinggi dan bahkan menurun, sementara kadar kolagenase-1 secara bertahap meningkat. Ada bukti bahwa pada osteoartritis, kolagenase-1 terutama terlibat dalam proses inflamasi pada tulang rawan artikular, sementara kolagenase-3 terlibat dalam remodeling jaringan. Kolagenase-3, yang diekspresikan dalam tulang rawan pasien OA, mendegradasi kolagen tipe II lebih intensif daripada kolagenase-1.

Dari perwakilan kelompok kedua metalloprotease, tiga juga telah diidentifikasi dalam stromelysin manusia: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10), dan stromelysin-3 (MMP-11). Saat ini, diketahui bahwa hanya stromelysin-1 yang terlibat dalam proses patologis pada osteoartrosis. Stromelysin-2 tidak terdeteksi pada membran sinovial pasien dengan osteoartrosis, tetapi ditemukan dalam jumlah yang sangat kecil pada fibroblas sinovial pasien dengan artritis reumatoid. Stromelysin-3 juga ditemukan pada membran sinovial pasien dengan artritis reumatoid di dekat fibroblas, terutama di zona fibrosis.

Dalam kelompok gelatinase pada jaringan tulang rawan manusia, hanya dua yang telah teridentifikasi: gelatinase 92 kD (gelatinase B, atau MMP-9) dan gelatinase 72 kD (gelatinase A, atau MMP-2); pada pasien dengan osteoartritis, peningkatan kadar gelatinase 92 kD ditentukan.

Baru-baru ini, kelompok MMP lain telah diidentifikasi yang terlokalisasi pada permukaan membran sel dan disebut MMP tipe membran (MMP-MT). Kelompok ini mencakup empat enzim - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Ekspresi MMP-MT telah ditemukan pada tulang rawan artikular manusia. Meskipun MMP-MT-1 memiliki sifat kolagenase, kedua enzim MMP-MT-1 dan MMP-MT-2 mampu mengaktifkan gelatinase-72 kDa dan kolagenase-3. Peran kelompok MMP ini dalam patogenesis OA perlu diklarifikasi.

Proteinase disekresikan dalam bentuk zimogen, yang diaktifkan oleh proteinase lain atau senyawa merkuri organik. Aktivitas katalitik MMP bergantung pada keberadaan seng di zona aktif enzim.

Aktivitas biologis MMP dikendalikan oleh TIMP spesifik. Hingga saat ini, tiga jenis TIMP telah diidentifikasi yang ditemukan dalam jaringan artikular manusia: TIMP-1–TIMP-3. Jenis keempat TIMP telah diidentifikasi dan dikloning, tetapi belum terdeteksi dalam jaringan artikular manusia. Molekul-molekul ini secara spesifik mengikat situs aktif MMP, meskipun beberapa di antaranya mampu mengikat situs aktif progelatinase 72 kD (TIMP-2, -3, -4) dan progelatinase 92 kD (TIMP-1 dan -3). Bukti menunjukkan bahwa pada OA, terdapat ketidakseimbangan antara MMP dan TIMP dalam tulang rawan artikular, yang mengakibatkan defisiensi inhibitor relatif, yang mungkin sebagian disebabkan oleh peningkatan kadar MMP aktif dalam jaringan. TIMP-1 dan -2 ditemukan dalam tulang rawan artikular dan disintesis oleh kondrosit. Pada osteoartrosis, hanya TIMP tipe I yang terdeteksi dalam membran sinovial dan cairan sinovial. TIMP-3 ditemukan secara eksklusif di ECM. TIMP-4 memiliki hampir 50% urutan asam amino yang sama dengan TIMP-2 dan 38% dengan TIMP-1. Pada sel target lainnya, TIMP-4 bertanggung jawab untuk memodulasi aktivasi progelatinase 72 kD pada permukaan sel, yang menunjukkan peran penting sebagai pengatur remodeling ECM yang spesifik pada jaringan.

Mekanisme lain untuk mengendalikan aktivitas biologis MMP adalah aktivasi fisiologisnya. Dipercayai bahwa enzim dari famili protease serin dan sistein, seperti AP/plasmin dan cathepsin B, masing-masing, merupakan aktivator fisiologis MMP. Peningkatan kadar urokinase (uAP) dan plasmin telah ditemukan pada tulang rawan artikular pasien dengan osteoartritis.

Meskipun beberapa jenis cathepsin ditemukan dalam jaringan sendi, cathepsin-B dianggap sebagai aktivator MMP yang paling mungkin dalam tulang rawan. Inhibitor fisiologis protease serin dan sistein telah ditemukan dalam jaringan sendi manusia. Aktivitas inhibitor AP-1 (IAI-1), serta protease sistein, berkurang pada pasien dengan osteoartritis. Mirip dengan MMP/TIMP, ketidakseimbangan antara protease serin dan sistein dan inhibitornya dapat menjelaskan peningkatan aktivitas MMP dalam tulang rawan artikular pasien dengan osteoartritis. Selain itu, MMP mampu mengaktifkan satu sama lain. Misalnya, stromelysin-1 mengaktifkan kolagenase-1, kolagenase-3, dan gelatinase 92 kD; kolagenase-3 mengaktifkan gelatinase 92 kD; MMP-MT mengaktifkan kolagenase-3, dan gelatinase-72 kDa mempotensiasi aktivasi ini; MMP-MT juga mengaktifkan gelatinase 72 kDa. Sitokin dapat dibagi menjadi tiga kelompok - destruktif (inflamasi), regulasi (termasuk anti-inflamasi) dan anabolik (faktor pertumbuhan).

Jenis sitokin (menurut van den Berg WB dkk)

Merusak	Interleukin-1 TNF-a Faktor penghambat leukemia Interleukin-17
Peraturan	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Penghambat enzim
Anabolik	Faktor pertumbuhan mirip insulin TGF-b Protein morfogenetik tulang Protein morfogenetik yang berasal dari tulang rawan

Sitokin yang bersifat merusak, khususnya IL-1, menginduksi peningkatan pelepasan protease dan menghambat sintesis proteoglikan dan kolagen oleh kondrosit. Sitokin pengatur, khususnya IL-4 dan -10, menghambat produksi IL-1, meningkatkan produksi antagonis reseptor IL-1 (IL-1RA) dan mengurangi kadar NO sintase dalam kondrosit. Dengan demikian, IL-4 menangkal IL-1 dalam tiga arah: 1) mengurangi produksi, mencegah efeknya, 2) meningkatkan produksi "pemulung" utama IL-1RA dan 3) mengurangi produksi "pembawa pesan" sekunder utama NO. Selain itu, IL-4 mengurangi degradasi enzimatik jaringan. Secara in vivo, efek terapi yang optimal dicapai dengan kombinasi IL-4 dan IL-10. Faktor anabolik seperti TGF-β dan IGF-1 sebenarnya tidak mengganggu produksi atau aksi IL-1, tetapi menunjukkan aktivitas yang berlawanan, misalnya, merangsang sintesis proteoglikan dan kolagen, menekan aktivitas protease, dan TGF-β juga menghambat pelepasan enzim dan merangsang inhibitornya.

Sitokin proinflamasi bertanggung jawab atas peningkatan sintesis dan ekspresi MMP dalam jaringan artikular. Mereka disintesis dalam membran sinovial dan kemudian berdifusi ke dalam tulang rawan artikular melalui cairan sinovial. Sitokin proinflamasi mengaktifkan kondrosit, yang pada gilirannya juga mampu menghasilkan sitokin proinflamasi. Pada sendi yang terkena osteoartrosis, peran efektor inflamasi dimainkan terutama oleh sel-sel membran sinovial. Sinovosit dari jenis makrofaglah yang mengeluarkan protease dan mediator inflamasi. Di antara mereka, IL-f, TNF-a, IL-6, faktor penghambat leukemia (LIF) dan IL-17 paling "terlibat" dalam patogenesis osteoartrosis.

Zat aktif biologis yang merangsang degradasi tulang rawan artikular pada osteoartritis

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Faktor perangsang koloni: makrofag (monosit) dan granulosit-makrofag
• Zat P
• Halaman ₂
• Aktivator plasminogen (jenis jaringan dan urokinase) dan plasmin
• Metalloprotease (kolagenase, ellastase, stromelisin)
• Katepsin A dan B
• Trilsi
• Lipopolisakarida bakteri
• Fosfolipase Ag

Data literatur menunjukkan bahwa IL-1 dan, mungkin, TNF-a adalah mediator utama kerusakan jaringan sendi pada osteoartrosis. Namun, masih belum diketahui apakah mereka bertindak secara independen satu sama lain atau apakah ada hierarki fungsional di antara mereka. Model hewan osteoartrosis telah menunjukkan bahwa blokade IL-1 secara efektif mencegah kerusakan tulang rawan artikular, sementara blokade TNF-a hanya menyebabkan penurunan peradangan pada jaringan sendi. Peningkatan konsentrasi kedua sitokin ditemukan di membran sinovial, cairan sinovial, dan tulang rawan pasien. Dalam kondrosit, mereka mampu meningkatkan sintesis tidak hanya protease (terutama MMP dan AP), tetapi juga kolagen minor, seperti tipe I dan III, dan mengurangi sintesis kolagen tipe II dan IX dan proteoglikan. Sitokin ini juga merangsang spesies oksigen reaktif dan mediator inflamasi seperti PGE ₂. Akibat dari perubahan makromolekul pada tulang rawan artikular pada osteoartritis adalah ketidakefektifan proses reparatif, yang mengarah pada degradasi tulang rawan lebih lanjut.

Sitokin proinflamasi yang disebutkan di atas memodulasi proses supresi/aktivasi MMP pada osteoartrosis. Misalnya, ketidakseimbangan antara kadar TIMP-1 dan MMP pada tulang rawan pada osteoartrosis dapat dimediasi oleh IL-1, karena sebuah studi in vitro menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi IL-1 beta menyebabkan penurunan konsentrasi TIMP-1 dan peningkatan sintesis MMP oleh kondrosit. Sintesis AP juga dimodulasi oleh IL-1 beta. Stimulasi in vitro kondrosit tulang rawan artikular dengan IL-1 menyebabkan peningkatan sintesis AP yang bergantung pada dosis dan penurunan tajam dalam sintesis iAP-1. Kemampuan IL-1 untuk menurunkan sintesis iAP-1 dan merangsang sintesis AP merupakan mekanisme ampuh untuk pembentukan plasmin dan aktivasi MMP. Selain itu, plasmin bukan hanya enzim yang mengaktifkan enzim lain, tetapi juga berpartisipasi dalam proses degradasi tulang rawan melalui proteolisis langsung.

IL-ip disintesis sebagai prekursor tidak aktif dengan massa 31 kD (pre-IL-ip), dan kemudian, setelah pembelahan peptida sinyal, diubah menjadi sitokin aktif dengan massa 17,5 kD. Dalam jaringan sendi, termasuk membran sinovial, cairan sinovial, dan tulang rawan artikular, IL-ip ditemukan dalam bentuk aktif, dan penelitian in vivo telah menunjukkan kemampuan membran sinovial pada osteoartrosis untuk mengeluarkan sitokin ini. Beberapa protease serin mampu mengubah pre-IL-ip menjadi bentuk bioaktifnya. Pada mamalia, sifat-sifat tersebut hanya ditemukan dalam satu protease, yang termasuk dalam keluarga enzim spesifik sistein aspartat dan disebut enzim pengubah IL-1β (ICF, atau kaspase-1). Enzim ini mampu secara khusus mengubah pre-IL-ip menjadi IL-ip "matang" yang aktif secara biologis dengan massa 17,5 kD. ICF adalah proenzim 45 kD (p45) yang terlokalisasi di membran sel. Setelah pembelahan proteolitik dari proenzim p45, terbentuk dua subunit yang dikenal sebagai p10 dan p20, yang dicirikan oleh aktivitas enzimatik.

TNF-a juga disintesis sebagai prekursor yang terikat membran dengan massa 26 kDa; melalui pembelahan proteolitik, ia dilepaskan dari sel sebagai bentuk aktif yang larut dengan massa 17 kDa. Pembelahan proteolitik dilakukan oleh enzim pengubah TNF-a (TNF-AC), yang termasuk dalam famili adamalizin. AR Amin dkk. (1997) menemukan peningkatan ekspresi mRNA TNF-AC pada tulang rawan artikular pasien dengan osteoartritis.

Aktivasi biologis kondrosit dan sinovosit oleh IL-1 dan TNF-a dimediasi dengan mengikat reseptor spesifik pada permukaan sel - IL-R dan TNF-R. Dua jenis reseptor telah diidentifikasi untuk setiap sitokin - IL-IP tipe I dan II dan TNF-R tipe I (p55) dan II (p75). IL-1PI dan p55 bertanggung jawab atas transmisi sinyal dalam sel jaringan sendi. IL-1R tipe I memiliki afinitas yang sedikit lebih tinggi untuk IL-1beta daripada untuk IL-1a; IL-1R tipe II, sebaliknya, memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk IL-1a daripada untuk IL-ip. Masih belum jelas apakah IL-IP tipe II dapat memediasi sinyal IL-1 atau hanya berfungsi untuk menghambat secara kompetitif asosiasi IL-1 dengan IL-1R tipe I. Kondroitida dan fibroblas sinovial pasien osteoartritis mengandung IL-1PI dan p55 dalam jumlah besar, yang selanjutnya menjelaskan sensitivitas tinggi sel-sel ini terhadap stimulasi oleh sitokin terkait. Proses ini menyebabkan peningkatan sekresi enzim proteolitik dan kerusakan tulang rawan artikular.

Keterlibatan IL-6 dalam proses patologis pada osteoartritis tidak dapat dikesampingkan. Asumsi ini didasarkan pada pengamatan berikut:

• IL-6 meningkatkan jumlah sel inflamasi di membran sinovial,
• IL-6 menstimulasi proliferasi kondrosit,
• IL-6 meningkatkan efek IL-1 dalam meningkatkan sintesis MMP dan menghambat sintesis proteoglikan.

Namun, IL-6 mampu menginduksi produksi TIMPs, tetapi tidak mempengaruhi produksi MMPs, sehingga diyakini bahwa sitokin ini terlibat dalam proses penghambatan degradasi proteolitik tulang rawan artikular, yang dilakukan melalui mekanisme umpan balik.

Anggota lain dari keluarga IL-6 adalah LIF, suatu sitokin yang diproduksi oleh kondrosit yang diperoleh dari pasien dengan osteoartrosis sebagai respons terhadap stimulasi oleh sitokin proinflamasi IL-1p dan TNF-a. LIF menstimulasi resorpsi proteoglikan tulang rawan, serta sintesis MMP dan produksi NO. Peran sitokin ini dalam osteoartrosis belum sepenuhnya dijelaskan.

IL-17 adalah homodimer 20-30 kD dengan efek mirip IL-1, tetapi tidak terlalu kentara. IL-17 menstimulasi sintesis dan pelepasan sejumlah sitokin proinflamasi, termasuk IL-1p, TNF-a, IL-6, dan MMP dalam sel target, seperti makrofag manusia. Selain itu, IL-17 menstimulasi produksi NO oleh kondrosit. Seperti LIF, peran IL-17 dalam patogenesis OA masih kurang diteliti.

Radikal bebas anorganik NO berperan penting dalam degradasi tulang rawan artikular pada OA. Kondrosit yang diisolasi dari pasien dengan osteoartritis menghasilkan NO dalam jumlah yang lebih tinggi baik secara spontan maupun setelah stimulasi dengan sitokin proinflamasi dibandingkan dengan sel normal. Kandungan NO yang tinggi telah ditemukan dalam cairan sinovial dan serum pasien dengan osteoartritis - ini adalah hasil dari peningkatan ekspresi dan sintesis NO sintase yang diinduksi (hNOC), enzim yang bertanggung jawab untuk produksi NO. Baru-baru ini, DNA hNOC spesifik kondrosit dikloning, dan urutan asam amino enzim tersebut ditentukan. Urutan asam amino menunjukkan 50% identitas dan 70% kesamaan dengan hNOC khusus untuk endotelium dan jaringan saraf.

NO menghambat sintesis makromolekul ECM tulang rawan artikular dan menstimulasi sintesis MMP. Selain itu, peningkatan produksi NO disertai dengan penurunan sintesis antagonis IL-IP (IL-1RA) oleh kondrosit. Dengan demikian, peningkatan kadar IL-1 dan penurunan IL-1RA menyebabkan hiperstimulasi NO dalam kondrosit, yang pada gilirannya menyebabkan peningkatan degradasi matriks tulang rawan. Ada laporan tentang efek terapeutik in vivo dari penghambat hNOC selektif pada perkembangan osteoartrosis eksperimental.

Inhibitor sitokin alami mampu secara langsung mencegah sitokin terikat pada reseptor membran sel, sehingga mengurangi aktivitas proinflamasinya. Inhibitor sitokin alami dapat dibagi menjadi tiga kelas berdasarkan cara kerjanya.

Kelas inhibitor pertama mencakup antagonis reseptor yang mencegah pengikatan ligan ke reseptornya dengan cara bersaing untuk mendapatkan tempat pengikatan. Hingga saat ini, inhibitor semacam itu hanya ditemukan untuk IL-1 - ini adalah inhibitor kompetitif sistem IL-1/ILIP yang disebutkan di atas, IL-1 PA. IL-1 PA menghambat banyak efek yang diamati pada jaringan sendi pada osteoartritis, termasuk sintesis prostaglandin oleh sel sinovial, produksi kolagenase oleh kondrosit, dan degradasi BM tulang rawan artikular.

IL-1RA ditemukan dalam berbagai bentuk - satu larut (rIL-1RA) dan dua interseluler (μIL-lPAI dan μIL-1RAP). Afinitas bentuk larut IL-1RA 5 kali lebih tinggi daripada bentuk interseluler. Meskipun penelitian ilmiah intensif, fungsi yang terakhir masih belum diketahui. Percobaan in vitro telah menunjukkan bahwa penghambatan aktivitas IL-1beta memerlukan konsentrasi IL-1RA 10-100 kali lebih tinggi dari biasanya, sedangkan kondisi in vivo memerlukan peningkatan konsentrasi IL-1RA seribu kali lipat. Fakta ini sebagian dapat menjelaskan kekurangan relatif IL-1RA dan kelebihan IL-1 dalam sinovium pasien dengan osteoartrosis.

Kelas kedua penghambat sitokin alami adalah reseptor sitokin terlarut. Contoh penghambat tersebut pada manusia yang terkait dengan patogenesis osteoartritis adalah rIL-1R dan pp55. Reseptor sitokin terlarut adalah bentuk pendek dari reseptor normal; ketika mengikat sitokin, reseptor tersebut mencegah pengikatannya ke reseptor terkait membran sel target, yang bekerja melalui mekanisme antagonisme kompetitif.

Prekursor utama reseptor terlarut adalah IL-1RP yang terikat membran. Afinitas rIL-IP untuk IL-1 dan IL-1RA berbeda. Dengan demikian, rIL-1RN memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk IL-1β daripada untuk IL-1RA, dan rIL-1PI menunjukkan afinitas yang lebih tinggi untuk IL-1RA daripada untuk IL-ip.

Terdapat pula dua jenis reseptor terlarut untuk TNF - pp55 dan pp75, seperti reseptor IL-1 terlarut, reseptor ini dibentuk dengan "pelepasan". In vivo, kedua reseptor ditemukan di jaringan sendi yang terkena. Peran reseptor TNF terlarut dalam patogenesis osteoartrosis masih diperdebatkan. Diasumsikan bahwa dalam konsentrasi rendah, reseptor ini menstabilkan struktur tiga dimensi TNF dan meningkatkan waktu paruh sitokin bioaktif, sementara konsentrasi tinggi pp55 dan pp75 dapat mengurangi aktivitas TNF melalui antagonisme kompetitif. Mungkin, pp75 dapat bertindak sebagai pembawa TNF, memfasilitasi pengikatannya ke reseptor yang terkait membran.

Kelas ketiga penghambat sitokin alami diwakili oleh sekelompok sitokin anti-inflamasi, yang meliputi TGF-beta, IL-4, IL-10, dan IL-13. Sitokin anti-inflamasi mengurangi produksi pro-inflamasi dan beberapa protease, serta merangsang produksi IL-1RA dan TIMP.